基于琼脂糖膜为载体的抗体芯片工作条件的优化

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1、基于琼脂糖膜为载体的抗体芯片工作条件的优化作者：朱颖，吕林莉，陆祖宏，刘必成【摘要】目的：优化以琼脂糖修饰的玻片为载体的抗体微阵列的制备方法，提高微阵列信噪比及检测灵敏度。方法：选取单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）作为待检的靶蛋白，在琼脂糖膜上首先固定MCP-1捕获抗体，经过洗涤、封闭，然后依次加入标准抗原、生物素标记的检测抗体以及亲和素标记的cy3，分别孵育、洗涤后，激光共聚焦扫描仪扫描获取图像，分析各点的荧光强度，根据荧光强度确定捕获抗体的最佳固定时间、温度以及最适宜的洗涤缓冲液。结果：与4、37℃过夜固定相比，捕获抗体室温(25℃左右)过夜固定时，蛋白质在载体上的固定效率和反应活

2、性最高；捕获抗体过夜固定比固定2h获得更高的检测灵敏度；另外，通过比较相同pH值不同溶质缓冲液的洗涤效应，pH7.4的缓冲液PBST可获得更优信号强度。结论：本研究优化了以琼脂糖修饰的玻片为载体的蛋白质微阵列的反应条件，提高了微阵列的检测灵敏度。【关键词】抗体芯片；琼脂糖；玻片；灵敏度；洗涤缓冲液；固定时间；固定温度抗体芯片又称抗体微阵列(antibodymicroarray,ABM)，作为蛋白质芯片的一种，是为满足蛋白组学研究的需要在基因芯片的基础上发展起来的生物芯片家族的新成员［1］。芯片上固定的是特异性抗体，可以通过特异性免疫反应捕获待测样品中的抗原，具有高通量、高特异性及平行性

3、分析的优点，目前已被应用到许多领域［2］。但是蛋白组学本身的复杂性决定了针对蛋白组学的检测技术必然面临很多的挑战，如对检测蛋白的通量、检测动力学范围和检测低限等。由于生物样品尤其是临床标本中与疾病密切相关的蛋白质丰度往往很低，为了实现抗体芯片在生物学研究中的应用，需要对实验流程的每一个步骤进行优化，从而使得灵敏度得到提高。本研究旨在通过比较抗体芯片构建过程中的基本实验条件，优化以琼脂糖修饰的玻片为载体的抗体微阵列的制备。我们在过去的实验基础上，比较了反应过程中不同洗涤缓冲液，以及捕获抗体固定时间、温度等实验条件对信号强度、信噪比的影响。1材料与方法1.1试剂与仪器单核细胞趋化蛋白1（m

4、onocytechemoattractantprotEin1，MCP-1）抗体对和标准抗原购自BD-PharMingen公司，链酶亲和素-cy3购自Zymed公司，小牛血清白蛋白(bovineseriumalbumin，BSA)和琼脂糖购自Sigma公司，Milli-Q超纯水仪购自Millipore公司，其他试剂购自上海试剂厂；点样仪PixSys5500arrayer购自PackardBioscience公司，激光共聚焦芯片扫描仪Lux-ScanTM-10K(A)及图像分析软件SpotDataPro2.0均购自博奥公司。1.2方法1.2.1载体的制备超纯水配制1%琼脂糖溶液，微波炉煮沸

5、至完全溶解；将3ml左右琼脂糖溶液覆盖至预热的清洁玻片上，室温凝固后置37℃烤箱烘干，置室温保存备用。1.2.2载体的活化在下一步点样前，琼脂糖膜玻片置于20mmol·L-1NaIO4溶液中室温下活化30min。接着0.01mmol·L-1pH7.4PBS洗涤5min×3次，氮气流吹干后立即点样。1.2.3点样靶标蛋白经点样缓冲液（0.01mol·L-1PBS溶液，pH7.4，含甘油200ml·L-1）以一定浓度比分别稀释，置点样板孔。按预先设计的阵列用点样仪进行机器点样,如图1所示。点样后玻片置湿盒密封，分别以不同温度、不同时间固定。每张玻片点10个相同的亚阵列，每个样品均重复4次。

6、自上而下5个样品随实验目的不同有所区别，常用的样品自上而下分别是链酶亲和素-cy3（阳性控制）、2个倍比稀释的MCP-1捕获抗体（Cap-Ab1、Cap-Ab2浓度分别为250、125μg·ml-1）、200μg·ml-1BSA（阴性控制）、生物素标记的检测抗体（另一个阳性控制）。图1抗体微阵列点样布局Fig1Schematiclayoutofantibodymicroarray1.2.4基于微阵列的免疫分析（1）非特异性结合位点的封闭：2%BSA/PBS，37℃恒温水浴封闭2h；（2）PBST洗涤5min×3次，氮气吹干；（3）对同一玻片不同亚阵列覆盖适量不同浓度抗原溶液或待测标本（

7、每个阵列4μl），注意避免不同阵列间的液体融合，置密闭湿盒，37℃恒温水浴；（4）PBST洗涤5min×4次，氮气吹干；（5）对同一玻片不同亚阵列覆盖适量检测抗体［加量及注意事项同（3）］，置密闭湿盒，37℃恒温水浴反应1h；（6）PBST洗涤5min×5次，氮气吹干；（7）对同一玻片不同亚阵列覆盖适量链酶亲和素-cy3,置密闭湿盒，37℃恒温水浴反应20min；（8）PBST洗涤5min×6次，氮气吹干。1.2.5图像扫描与数据分析激光共聚焦