中医肝肺关系的相关性研究

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1、免疫组化染色切片计算机定量分析：每一切片经物镜为20倍的光学显微镜下选择阳性细胞较多的区域（集中）采集3-5个光镜视野输入到HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统内在相同的背底倍体条件下选择相应的参数进行计算机完全定量分析。上述结果均作T检验和卡方检验（软件包由武汉同济医科大学千屏影像工程公司商业提供）并计算平均光密度值（即OD值，平均光密度值与抗原含量呈正比关系，即光密度值越高，抗原含量越多，阳性表达越强）。（3）肺组织匀浆检测GSH的含量，肝组织匀浆检测GSH、MDA的含量取左肺组织，肝组织，洗净称重后，冰盘上剪碎，每克肺组织加入10ml生理盐水，使用电动匀浆机在冰浴中匀浆，

2、取匀浆液置离心管中，4℃15000r/min离心20min，取上清液，保存于-80℃超低温冰箱中备用。比色法检测肺组织中GSH、肝组织中GSH、MDA的含量。GSH测定操作步骤：组织匀浆GSH含量测定根据二硫代二硝基苯甲酸与疏基化合物反应时能产生一种黄色化合物，可用于比色测定的原理进行测定。1.显色反应：空白管标准管测定管测定空白管双蒸水（ml）0.030.50.5mmol/LGSH标准品（ml）0.03样本*（ml）0.030.03试剂一（ml）0.030.030.030.03试剂二（ml）1111试剂三（ml）0.50.50.5混匀，室温静置5分钟，于412nm处，0.5cm比色杯，蒸

3、馏水调零，测各管OD值。*样本说明：组织为10%组织匀浆**空白管、标准管每批只需做1-2只，测定空白管需每例样本均做。2.计算公式蛋白浓度=（测定管OD值/标准管OD值）*蛋白标准浓度用考马斯亮兰法计算出标本蛋白含量，然后根据公式：组织匀浆中GSH（mg/gprot）=（测定管OD值-测定空白管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）*标准管浓度（0.5mmol/l）*GSH分子量（307）/组织匀浆蛋白含量-4-（gprot/l），计算出样本中GSH的含量（ug/g）。MDA测定操作步骤：机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，可攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，成包括丙

4、二醛在内的脂质过氧化产物，导致细胞代谢及功能障碍。测量丙二醛的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤程度。MDA可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥酸所以此法称为TBA法。1.加样表标准管标准空白管测定管测定空白管10nmol/l标准品（ml）0.1ml无水乙醇（ml）0.1ml测试样品（ml）0.1ml0.1ml试剂一（ml）0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml混匀（摇动几下试管架）试剂二（ml）3ml3ml3ml3ml试剂三（ml）1ml1ml1ml50%冰醋酸（ml）1ml各管混匀后，试管口用保鲜膜扎紧，刺一小孔，置于沸水中加热40

5、分钟，取出后流水冷却，然后4000r/min离心10分钟，取上清液于532nm，1cm光径，蒸馏水调零，比色测各管吸光度值。2.蛋白含量测定：考马斯亮兰蛋白法，测得待侧样本蛋白浓度。MDA含量按下面计算公式计算：MDA组织中的含量=（测定管吸光度-测定空白管吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）*标准品浓度/蛋白含量（4）透射电镜下观察肝组织超微结构变化快速取出肝组织，用PBS缓冲液冲洗组织周围的血液等污物，严格定位取材并即刻放入4℃3%戊二醛固定液；2～3分钟后修整样品为1mm3，并放入新鲜的3%戊二醛固定液；之后按常规TEM样品制备方法漂洗、OsO4固定、漂洗、脱水、浸透、Spo

6、n812包埋；经柠檬酸铅和醋酸铀电子染色后，用H-800电镜观察。5（三）统计学处理采用SPSS13.0分析软件进行统计学处理实验数据，各组数据用X±S表示，P<0.05、P<0.01为有统计学意义。多组比较采用方差分析，两组比较采用t检验或t′检验（两组方差不齐时，按t′检验判断P值）。三、实验结果与分析（一）一般情况实验过程中，部分造模组有大鼠死亡，考虑可能为体质不耐受而致死。正常对照组大鼠活泼好动，毛发有光泽，体重逐渐增加，呼吸平稳，无任何特殊表现，大鼠之间偶有相互厮打，无明显行为学变化。肺气虚组大鼠活动量减少，拱背蜷卧，体重增幅减轻，呼吸急促，咳嗽频作，撮毛，毛色发黄，食量减少，行

7、动迟缓。大鼠于造模开始第1天即出现明显的咳嗽，之后不熏烟时也出现咳嗽，后咳嗽频率减少，声音减小，渐转为慢性咳嗽，口鼻潮湿，分泌物较多。造模后期大鼠开始出现气急，部分可闻及哮鸣音。肝郁化火组大鼠的体重、饮水量增加，易怒撕咬，竖立对峙，怒叫容易激惹，咬人，喜欢扎堆、贴边，胡须下垂，大便松散而特臭，塘薄松软，部分大鼠因相互撕咬出现脱毛，鼻部出血。平时无刺激时，同笼之间常出现互相撕咬。进食、毛色等无明显变化，尾干，覆有棕色鳞片，