顺铂对人鼻咽癌cne2z细胞端粒酶活性和细胞周

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1、顺铂对人鼻咽癌CNE2Z细胞端粒酶活性和细胞周【摘要】目的研究顺铂对人鼻咽癌E2Z细胞端粒酶活性、细胞周期及凋亡的影响，以探讨顺铂诱导E2Z细胞凋亡与端粒酶活性水平的关系以及顺铂诱导鼻咽癌细胞凋亡的可能机制。方法分别以不同的药物浓度作用于体外培养的E2Z细胞不同的时间，用TRAPELISA的方法定量检测E2Z细胞在顺铂处理前后的端粒酶活性水平，同步进行细胞形态观察，流式细胞仪分析细胞周期的改变并检测凋亡。结果E2Z细胞端粒酶呈阳性。用不同浓度的顺铂不同的时间作用于E2Z细胞，结果细胞周期被阻滞在G1期，出现细胞凋亡，下调端粒酶活性，且呈

2、时间依赖性及剂量依赖性。结论化疗药物顺铂可能是通过改变细胞周期分布（G1期阻滞）并同时诱导细胞凋亡、下调其端粒酶活性而发挥抗癌作用的，故可将化疗前后细胞端粒酶活性的变化作为鼻咽癌化疗敏感性指标之一。【关键词】端粒酶；鼻咽肿瘤；顺铂；凋亡EffectofCisplatinonTelomeraseActivityandCellCycleandApoptosisinHumanNasopharyngealCarcinomaE2ZCellsKeyerase；Nasopharyngealneoplasm；Cisplatin；Apoptosis近来研究发现，端粒酶

3、的活化可以避免端粒的缩短，从而使细胞发展成为永生化细胞或无限增殖的肿瘤细胞，通过抑制端粒酶的活性可以抑制肿瘤细胞的生长,可增加整个基因组的不稳定性或使细胞的增殖向分化、衰老和凋亡方向转变[14]。因此，我们采用TRAP—ELISA法定量检测E2Z细胞用顺铂处理前后的端粒酶活性，并同步检测细胞周期变化和凋亡。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞培养鼻咽癌细胞系E2Z为本室保存。设立实验组和对照组，两组癌细胞同时传代，实验组于传代培养24h后加入工作浓度的顺铂，继续培养24h、48h、72h后收集细胞。1.1.2药品和试剂顺铂为齐鲁制药厂产品，工作浓

4、度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L[5，6]。TelomerasePCRELISA检测试剂盒为德国BoehringerMannhein公司产品。DEPC、牛血清白蛋白购自上海华舜生物工程有限公司。考马斯亮兰G250购自Sigma公司。1.2实验方法1.2.1细胞形态观察定时在倒置显微镜下观察细胞形态。各组细胞取适量，加入荧光染料Hoechst33258及PI至终浓度分别为10μg/ml、20μg/ml，37℃避光30min，紫外光激发，荧光显微镜下观察细胞。细胞经Hoechst33258/PI双重染色后，在荧光显微镜下经紫外光激

5、发，发出粉红色荧光，染色质聚集呈不均匀块状的细胞为凋亡细胞；发出蓝色荧光且染色质分布均匀的为活细胞。1.2.2流式细胞仪分析各组细胞各取1×105个细胞，调成细胞悬液，加PBS0.3ml用RNA酶A37℃处理细胞30min，加300μlPI染15min，350目筛网过滤后用流式细胞仪检测凋亡细胞含量。如细胞凋亡发生时其小分子量DNA从细胞中丢失，使凋亡细胞的DNA含量降低而导至荧光染料对其可染性降低，在G0/G1期峰前出现亚二倍体峰（亚G1峰或凋亡峰）。1.2.3DNA片段分析各组细胞经50μl裂解液处理细胞10s，1500g×5min。移上清至另一微

6、量加10μl10%SDS，2μlRNAaseA，混匀，37℃水浴2h，加70μl10MNH4Ac，600μl无水乙醇沉淀DNA，4℃，1500g×15min，去上清，70%乙醇洗一次，真空抽干。加入40μlTE溶解沉淀DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳。细胞出现凋亡时，凋亡细胞的DNA降解后，在琼脂糖凝胶电泳带上可呈现梯状条带。1.2.4端粒酶活性检测1.2.4.1细胞TLMA蛋白的提取收集癌细胞，制备TLMA提取液[1]。并用考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量。1.2.4.2TRAPELISA检测取TLMA蛋白提取液1～5μl，阳性对照（试剂盒提供）2μl

7、，阴性对照（阳性对照65℃加热10min）2μl（蛋白含量均为50μg），加入25μlTRAPPCR扩增液和无菌DEPC水50μl混匀，PCR扩增。取上述PCR扩增产物5μl加变性液20μl混匀，置室温10min，加入杂交液225μl混匀后取100μl包被于预冷的抗地高辛酶标板中，37℃，300rpm孵育2h，2000g，离心，加入100μl过氧化物酶，18℃～22℃，300rpm孵育30min，加入100μlTMB底物显色液，18℃～22℃，300rpm孵育15min，终止反应；用酶标仪测其在波长450nm的吸光度A值。1.3结果判断阳性反应阈值为

8、A≥0.2[7]1.4统计学分析数据资料用SPSS10.0统计软件作t检验。2结果2.1细胞形