srf和myocardin在血管平滑肌细胞表型转

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1、SRF和Myocardin在血管平滑肌细胞表型转【摘要】目的探讨SRF和Myocardin在血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中相互作用的机制。方法采用免疫共沉淀和凝胶迁滞分析(EMSA)的方法检测不同表型的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用以及SRF与其顺式元件相互结合的能力。结果与传代培养处于去分化状态的VSMC相比，原代培养处于分化状态的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用明显增强，而且SRF与其顺式元件结合的能力显著提高。结论SRF通过与Myocardin相互作用形成多蛋白复合体，即可有效地提高SRF与DNA调控元件即CArG-box的结合

2、能力，启动肌特异性基因的表达，从而调控VSMC的表型转化。【关键词】Myocardin;血清应答因子;血管平滑肌细胞;表型　转化血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及向内膜下迁移是动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等心血管疾病的共同病理特征，而VSMC表型转化是上述机制发生的基础。因此，研究VSMC表型调节的分子机制，对上述相关疾病的防治具有重要意义。血清应答因子(SRF)与其顺式元件(CArG-box)之间的相互作用对于平滑肌标志基因的转录是非常重要的。但SRF这样普遍表达的转录因子能够选择性地激活平滑肌细胞特异性的基因转录，其机制尚不清楚。研究显示SRF对平滑肌特异性基因表

3、达　　的调节活性可受多个环节的调节，涉及SRF的表达、核转位、选择性拼接以及SRF自身的翻译后修饰等〔1，2〕。Myocardin与SRF相互作用而协同激活SRF依赖的基因转录最令人关注。但Myocardin在VSMC表型转化过程中的作用尚未见报道。故本研究观察在VSMC发生表型转化的过程中Myocardin和SRF相互作用的分子机制。　　1材料与方法　　1.1材料兔抗人Myocardin多克隆抗体(本室制备)，兔抗鼠SRF多克隆抗体(SantaCruz公司)，辣根过氧化物酶(HRP)-1标记的羊抗兔二抗(北京中山公司)，随机引物标记试剂盒、凝胶迁滞试验(EMSA)试剂

4、盒(Promega公司)，其他试剂均为进口或国产分析纯。　　1.2细胞培养取5周龄SD大鼠胸腹主动脉，用贴块法分离VSMC，加入含10%FBS的M199进行培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3～7代细胞进行实验。　　1.3原代VSMC培养按文献〔3〕方法。取5周龄SD大鼠胸腹主动脉，剪碎后，用0.01%Ⅳ型胶原酶和0.1%胰酶联合消化，8000r/min离心收集细胞，差速贴壁法纯化VSMC。　　1.4免疫共沉淀按文献〔4〕方法用三去污裂解液分别裂解原代培养和传代培养的VSMC，收集细胞裂解液，离心取上清加入明胶缓冲液后，加入兔抗鼠SRF多克隆抗体(或兔抗人Myoca

5、rdin多克隆抗体)，4℃摇动2h。随后，加入蛋白A-Sepharose，4℃摇动过夜。离心收集蛋白A-抗原-抗体三元复合物。依次用-洗涤缓冲液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ洗涤沉淀，离心后用2×SDS上样缓冲液悬浮沉淀，100℃加热3min后离心，取上清进行yocardin的相互作用。用法国VilberLourmat公司的BioID数码成像分析软件对22α基因启动子近端CArG-box的碱基序列合成正链及互补链ODNs(上海生工生物工程公司)，正链序列：5′-CTTTCCCCAAATATGGAGCCTG-3′。将合成的正链及其互补链ODNs溶解于3×柠檬酸钠(SSC)溶液中，加热至80℃

6、后，缓慢降温至55℃，使其退火生成双链ODNs。　　1.6凝胶阻滞分析(EMSA)按文献〔3〕方法从原代和传代培养的VSMC中提取核蛋白。各取10μg与末端标记的SM22α基因启动子近端CArG-box进行结合反应，以100倍过量的非标记探针作为特异性竞争结合对照。DNA-核蛋白复合物经4%PAGE分离后，-70℃放射自显影显现电泳区带的迁移变化。　　2结果　　2.1原代和传代培养的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用无论是用抗Myocardin抗体免疫沉淀原代和传代培养的VSMC提取物，再用抗SRF抗体做免疫印迹分析;还是用抗SRF抗体免疫沉淀原代和传代培养

7、的VSMC提取物，再用抗Myocardin抗体做免疫印迹分析，结果均表明，在传代培养的处于去分化状态的VSMC中，很难检测到SRF和Myocardin复合物的形成。而在原代培养的处于分化状态的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用明显增强。结果提示，SRF与Myocardin这个特异性转录因子的相互作用在VSMC表型转化中起着核心作用。见图1，图2。　　2.2原代和传代培养的VSMC中SRF与DNA结合能力的改变EMSA结果表明，从原代和传代培养的VSMC细胞中提取的核蛋白都可与SM22α启动子近端CArG-box相结合，在4%P