myocardin在大鼠血管平滑肌细胞表型转化中的作用机制

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1、Myocardin在大鼠血管平滑肌细胞表型转化中的作用机制【关键词】Myocardin;血清应答因子;血管平滑肌细胞;表型转化　血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化参与了多种心血管疾病的发生发展过程，研究表明血清应答因子(SRF)与其顺式元件CArG〔CC(A/T)6GG〕box的相互作用是启动VSMC特异性基因表达的核心机制〔1〕。但是，CArG元件并非VSMC特异性基因所特有，它广泛存在于平滑肌、心肌、骨骼肌以及一些非肌细胞中。因此，单用CArG与SRF相互作用很难解释基因表达的细胞特异性。Myocardin是2001年发现的核

2、蛋白SAP结构域家族的一个成员〔2〕，可在多种非肌细胞中，以SRF依赖的方式启动平滑肌特异性基因的表达〔3〕，但在VSMC表型转化过程中Myocardin的表达变化尚未见报道。本研究旨在探讨外源性Myocardin和SRF在VSMC中过表达时VSMC特异性标志基因的表达及细胞骨架的结构变化。　　1材料与方法　　1.1材料兔抗人SM22α多克隆抗体(本室制备)，小鼠抗大鼠SMαactin单克隆抗体(Sigma公司)，HRP1标记的羊抗兔、羊抗小鼠二抗(北京中山公司)，RTPCR试剂盒(AppliedBiosystems)，其他

3、试剂均为进口或国产分析纯。　　1.2细胞培养与转染取5周龄SD大鼠胸腹主动脉，用贴块法分离VSMC，加入含10%胎牛血清(FBS)的M199进行培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3～7代细胞进行实验。当细胞生长至70%密度时，用脂质体介导法分别转染或共转染pCGNSRF和pCDNAMyocardin表达质粒，所用质粒浓度为5μg/ml，操作按ESCORTTMⅣ转染试剂盒说明进行。分别在转染后48h收集不同条件处理的VSMC，提取总RNA和细胞总蛋白。　　1.3RTPCR用异硫氰酸胍一步法提取总RNA。以总RNA为模板，进行

4、RTPCR，检测不同条件处理的VSMC中SM22α和SMαactin基因的表达。SM22α上、下游引物序列为5′TTCTGCCTCAACATGGCCAAC3′和5′CACCTTCACTGGCTTGGATC3′。SMαactin引物序列为5′CCTGAAGTATCCGATAGAAC3′和5′GCCGACTCCATTCCAATGAA3′。反应以GAPDH作内参照，对模板用量进行标化。PCR产物经8%PAGE分离、鉴定。　　1.4C，提取细胞总蛋白，用改良酚试剂法测定蛋白含量。各组均取含80μg蛋白的裂解液经8%

5、SDSPAGE分离，通过电转移将蛋白印迹至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭膜上非特异性结合位点，继之与抗SRF抗体室温反应5h，洗膜三次。随后加入HRP1标记的二抗室温反应2h，4氯1萘酚/H2O2溶液显色。法国VilberLourmat公司的BioID数码成像分析软件对C用冷PBS清洗两次，2%多聚甲醛预固定10s，1%TritonX100处理20min，以除去胞浆内的可溶性蛋白。PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.2%考马斯亮蓝R250染色，蒸馏水漂洗，加拿大树胶封片。于显微镜下观察细胞骨架的变化。　　1.6统计学分析

6、所有数据均用x±s表示，采用SASV8软件进行统计学处理分析，组间比较用单因素方差分析检验。　　2结果　　2.1Myocardin和SRF激活VSMC特异性基因的表达由于SM22α和SMαactin是收缩型VSMC的最具特点的标志基因〔6〕，所以本研究中以二者的表达活性作为判定VSMC表型的依据。在正常培养的VSMC中，即使细胞生长至完全汇合而出现接触抑制时也难以检测到SM22α和SMαactin的mRNA，说明此时的VSMC处于去分化状态。当培养的VSMC单独转染SRF或Myocardin的表达质粒后，SM22α和SMα

7、actin的mRNA水平并未发生明显改变。当SRF和Myocardin的表达质粒共同转染培养的VSMC时，SM22α和SMαactin的mRNA水平显著增加，见图1和表1。这表明外源性Myocardin和SRF的强制表达可诱导处于增殖状态的VSMC进入静止期，并向收缩型转变。SRF和Myocardin的表达质粒共同转染VSMC引起的SM22α和SMαactin蛋白的表达变化进一步被yocardin的强制表达对细胞骨架的影响由于SM22α和SMαactin是参与调节VSMC细胞骨架结构表1VSMC中SM22α和SMα

8、actinmRNA光密度扫描分析结果　表2VSMC中SM22α和SMαactin蛋白表达变化的光密度扫描分析结果1.正常培养的VSMC;2.转染pCGNSRF表达质粒;3.转染pCDNAMyocardin表达质粒;4.共转染p