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时间:2018-10-24
《基因组定点修饰技术在动物基因组定点修饰中的应用研究进展》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、基因组定点修饰技术在动物基因组定点修饰中的应用研究进展 DOI:10.16660/j.cnki.1674-098X.2017.11.244 摘要:基因组靶向修饰效率低是目前基因治疗的难题之一。近年来基因组定点修饰技术得到了飞速的发展,为克服这一难题提供了新的途径。锌指核酸酶(ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)或规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术可以对DNA进行双链切割,通过细胞的同源重组修复机制,能够实现对靶基因进行高效的定点修饰。该文主要针对这三种基因
2、修饰工具,分别对其作用原理,在动物细胞基因定点修饰中的应用及其局限性进行综述,以期为构建动物疾病模型,治疗遗传疾病提供新思路。 关键词:基因定点修饰基因治疗ZFNsTALENsCRISPR/Cas9 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1674-098X(2017)04(b)-0244-02 基因组定点修饰技术是指利用基因工程的方法对基因组进行靶向改造的技术。基因组定点修饰技术为畜牧基因的改良、基因功能的研究以及遗传性疾病治疗提供了有力的工具,因此该技术对于构建动物疾病模型,治疗遗传疾病
3、都具有重要的意义。基因组定点修饰技术的发展经历了一个漫长过程。起初,科学家们通过同源重组的方法进行基因组修饰,但是自然条件下发生同源重组的几率非常低,只有10-6[1]。为了提高基因组定点修饰的效率,科学家们建立了Cre/loxP[2]、PiggyBac转座子系统[3],PhiC31整合酶系统[4]等方法。Cre/loxP可以进行条件性基因敲除或者敲入,目前主要应用于转基因动物模型的制备,但是首先要在基因组中插入loxP序列,如何提高loxP插入的效率仍然是一个亟待解决的问题。PiggyBac转座子
4、系统和PhiC31整合酶系统都可以实现外源基因的特异性整合,但是PiggyBac转座子系统会破坏细胞的内源基因,而PhiC31整合酶系统不能进行定点整合。近年来兴起的基因修饰技术如锌指核酸酶(ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)或规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术,克服了先前基因组定点修饰技术的缺陷,可以对DNA进行双链切割,通过细胞的同源重组修复机制,能够实现对靶基因进行高度特异和高效的定点修饰,为动物细胞基因组的定点修饰提供了新的途径。该文就这三种基因修饰
5、方法的作用原理、在动物基因组定点修饰中的应用进行综述,并分别剖析了其应用局限性,展望了这三大基因组修饰系统的应用前景,以期为构建动物疾病模型,治疗遗传疾病提供新思路。 1锌指核酸酶(ZFNs) 1.1ZFNs的作用原理 锌指核酸酶单体主要包括两部分:位于C末端的核酸酶结构域FokI和位于N端的特异性识别DNA的锌指蛋白(zincfngerprotein,ZFP)。ZFP通常由3~6个锌指组成折叠形成ββα的二级结构,每个锌指能够识别基因组中3bp长的DNA序列,因此单个ZFN可以识别9~18个
6、碱基。当两个锌指核酸酶单体分别与基因组中的特定序列结合且两个锌指核酸酶单体的分子间距在6~8bp时,FokI会形成二聚体发挥DNA切割活性。将DNA双链切断形成双链断裂切口。细胞会启动DNA修复机制,主要包括非同源重组末端连接修复和DNA同源重组修复。前者会造成靶位点附近小片段的随机插入或者缺失引起基因敲除;后者可以实现基因的敲入或者敲除。 1.2ZFNs在动物细胞基因定点修饰中的应用及其局限性 目前,锌指核酸酶已经在人类胚胎干细胞、果蝇、斑马鱼、大鼠、小鼠模式动物中实现了基因组的定点修饰。同时
7、,锌指核酸酶在遗传疾病治疗中也发挥了重要作用。2005年,美国的Sangamo公司利用锌指核酸酶对免疫缺陷相关基因Il2Rγ进行了定点修复。Sangamo公司利用锌指核酸酶实现了CCR5基因的定点修饰,从而提高T淋巴细胞对HIV病毒的抵抗力。2011年,Soldner等利用锌指核酸酶对α-synuclein的点突变位点进行定点修饰,从而对帕金森疾病进行疾病治疗。同年,Yusa利用锌指核酸酶造成DNA双链断裂然后利用同源重组的方法将α1-抗胰蛋白酶导入到细胞中在小鼠中实现了α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的肝
8、病的基因治疗。2014年,Genovese等利用锌指核酸酶在造血干细胞中插入Il2RG基因的cDNA,在免疫缺陷小鼠中重建造血系统。锌指核酸酶在基因治疗中发挥了重要作用,但是该技术本身仍然存在局限性,比如构建难,周期长,价格昂贵以及脱靶会导致细胞毒性。这些局限性限制了锌指核酸酶在基因治疗中的广泛应用。 2类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs) 2.1TALENs的作用原理 TALENs的构造类似于ZFN,主要是由DNA结合域和分子剪刀“FokI”组成。不同的
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