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1、www.roche-applied-science.com细胞转染的方法和产品精粹FuGENE®HD：颠峰之作2www.roche-applied-science.com何谓转染技术：是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。目的：对基因调节以及蛋白质的表达和功能等进行研究常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多
2、用于启动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染的种类细胞转染方法介绍I利用载体分子(化学方法)：化学物质辅助II直接进入细胞质：物理方法III利用病毒载体利用载体分子1.磷酸钙首先由Graham和vanderEb在1973年发现,接着由Wigler
3、等人进一步完善技术缺陷:pH值敏感,不可在许多细胞中表达,毒性较大,重复性小2.阳离子脂质体3.多组分转染试剂2.阳离子脂质体阳离子lipids和中性lipids混合便会形成单层脂质体(liposome),带正电高效转染,但需要繁琐的反应条件优化过程RAS产品:DOTAP:单价阳离子脂质体DOSPER:多价阳离子脂质体3.多组分转染试剂3.多组分转染试剂包括lipids和其它活性成分低毒,高效,无需反应条件优化过程FuGENE6:已证实可转染超过600种细胞株优势:剂量依赖性不明显,无需抗生素存在,极低的血清干扰性II物理方法电击,基因枪,微注射主
4、要应用于植物细胞,细菌(带有细胞壁)III病毒载体费时和生物安全的考量,应用非常局限其它方法转染方法比较影响转染效率的主要因素有：1、细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推荐在转染前24小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。2、血清大多数培养基在使用前需要加血清。通常血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转
5、染前建议先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。3、载体构建转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA、RNA、PCR产物、寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的
6、影响，如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成及合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因相同载体构建的正对照可排除毒性影响的干扰。4、DNA质量DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），需要在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。5、转染技术转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细
7、胞数量，培养及检测时间等。通常影响转染效率的因子DNA与转染试剂的比率细胞与脂质-DNA复合体温育时间无血清存在造成细胞活性下降抗生素存在16www.roche-applied-science.comRAS转染试剂FuGENE6非脂质体转染试剂,高效,超低毒性,适合多种细胞株X-tremeGENEsiRNA多组分转染试剂,可进行siRNA转染,或siRNA和表达质粒的共转染X-tremeGENEQ2专门针对Hela,Jurkat和K-562细胞株,报告蛋白表达水平较同类产品高约10倍ＤＯＴＡＰ单价阳离子脂质体,对反应体系及细胞株类型敏感,可转染带负
8、电的大分子,譬如DNA,RNA,核苷酸,蛋白质,及核酸蛋白复合体ＤＯＳＰＥＲ多价阳离子脂质体17www.roche-app
