蛋黄测定 文档

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1、蛋黄中胆固醇含量测定方法的研究胆固醇含量的分析方法有酶法、比色法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法等试剂盒法是基于酶法测定胆固醇的原理进行的比色法一种依据显色反应来分析的传统方法色谱法是适用范围较广、灵敏度较高的分析方法而高效液相色谱不需要载气在使用上较气相色谱和液相色谱-质谱联用的方法简便[6-11]。本试验对液相色谱法、皂化-比色法和试剂盒法测定蛋黄胆固醇的过程和结果进行研究和比较为鸡蛋胆固醇含量测定工作提供方法指导。1材料与方法1.1试验材料蛋黄由市售新鲜鸡蛋中取出胆固醇标准品纯度≥99.7%由中国计量科学研究院提供总胆固醇试

2、剂盒酶法由北京北化康泰临床试剂有限公司提供显色液为FeSO4-冰乙酸-浓硫酸将Fe⁃SO4100mg溶于1mL蒸馏水中再加入100mL冰乙酸混合溶解然后与100mL浓硫酸缓慢混匀冷却后使用。1.2试验方法1.2.1HPLC法取新鲜蛋黄稀释液浓度为0.1g·mL-11.0mL于10mL离心管中加入95%乙醇1.0mL用漩涡振荡器混匀后加入乙醚2.5mL再次混匀后加入石油醚2.5mL震荡混匀3000rpm离心5min移出上层萃取液在低于45℃下用氮气吹干加无水乙醇溶解残余物2.0mL用0.45μm有机微孔滤膜过滤后进样。色谱条件为色谱柱ZOR

3、BAXEclipseXDB-C184.6mm×150mm5μm流动相乙腈-异丙醇(4:1)V/V流速0.8mL·min-1柱温35℃检测波210nm进样量10μL。取胆固醇标准品用色谱级无水乙醇溶解配成浓度为1mg·mL-1的标准液取标准液稀释成不同浓度0~1000μg·mL-1以胆固醇浓度为横坐标峰面积值为纵坐标制作标准曲线。采用外标法定量分析样品中胆固醇含量。1.2.2皂化比色法称取鲜蛋黄100mg于25mL试管中加入KOH-甲醇溶液5mL200g·L-1漩涡震荡混匀置于80℃水浴恒温振荡器中皂化10min取出冷却至室温加入正己烷10mL漩

4、涡震荡混匀静置将上层液体移入10mL离心管中3000rpm离心10min取出上清液60℃下用氮气吹干。然后加入冰乙酸1mL溶解残余物再加入显色液3mL于60℃水浴15min在490nm下用722分光光度计进行比色分析同法做空白样。将胆固醇标准品用甲醇溶解配成1mg·mL-1溶液取不同体积胆固醇标准品溶液与样品做同样处理以胆固醇浓度为横坐标吸光度值为纵坐标制作工作曲线。根据样品的吸光度值计算样品中胆固醇含量。1.2.3试剂盒法样品前处理方法同1.2.1根据试剂盒说明将样品与工作液混合37℃保温5min后在波长500nm处比色测定吸光度值并根据样

5、品管和校准管的吸光度值及校准品浓度计算胆固醇含量胆固醇含量=测定管吸光度值校准管吸光度值×校准品浓度11.2.4加标回收率的测定量取0.1g·mL-1新鲜蛋黄稀释液0.5mL或新鲜蛋黄50mg加入1mg·mL-1的胆固醇标准液750μL按照上述3种方法进行处理并分析根据结果计算加标回收率。计算公式见式回收率=a-bc×100%（a为测得加标样中胆固醇的量、b为样品中胆固醇的量、c为加标量。）1.3数据处理采用Excel2007和SPSS16.0统计软件进行数据处理和分析结果以“平均值±标准误”表示。2试验结果2.1HPLC法测定蛋黄胆固

6、醇含量样品的高效液相色谱图见附图。由附图可知胆固醇的保留时间为14.662min。2.2测定结果比较3种方法测定结果见附表。通过对3种方法的比较发现HPLC法的测定结果低于皂化-比色法但差异不显著P>0.05而试剂盒法的测定结果较HPLC法高P<0.05这与Nogueira的结果相一致。【12】目前我国产胆固醇试剂盒均为血清总胆固醇试剂盒其测定原理是胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下生成胆甾烯酮再与氨基安替吡啉反应生成红色醌化物醌化物颜色深浅与胆固醇含量成正比试剂盒法测定结果较高的原因可能是蛋黄中固醇以外的甾醇类物质也同氨基安替吡啉反应生成有色

7、物使测定结果偏高[13]。HPLC法测定蛋黄胆固醇结果的偏差最小方法的重现性和再现性也好于其他两种方法因而HPLC法的精密度较高。皂化-比色法的偏差较大其原因可能是此法采用皂化、显色等多步操作增加了由仪器、试剂和操作等方面带来的系统误差另外蛋黄中胆固醇以外的物质也可能与硫酸反应而生成有色物给测定结果带来干扰。试剂盒法的精密度最低这可能与蛋黄样品中干扰物质较多有关。在样品中加入胆固醇标准品分析加标回收率的结果表明HPLC法的回收率最好因而准确度最高皂化-比色法居中试剂盒法的准确度最低。皂化-比色法的加标回收率偏低可能与胆固醇皂化不完全有关皂化时间

8、短样品中胆固醇未能被完全皂化但皂化时间长又可能会使样品中增加胆固醇以外的皂化产物而干扰测定结果。试剂盒法的加标回收率偏高一方面与甾醇干扰有关另一方