叶绿体色素的提取和分离

叶绿体色素的提取和分离

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1、叶绿体色素的提取和分离基础生物学实验(三)一、实验目的1、进一步理解叶绿体色素的提取、分离的原理、方法;2、了解叶绿素的光学特性在光合作用中的意义;二、实验原理叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质,主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当用适当的溶剂推动时,混合物中各种成分在两相(固定相和流动相)间具有不同的分配系数,所以移动速度不同,经过一定时间后,可将各种色素分开。

2、当叶绿素分子吸收光量子而转变成激发态时,分子很不稳定,当它变回到基态时发射出红光量子,称为萤光现象。叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,因而可与碱起皂化作用,产生的盐可溶于水中,利用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素分子中的镁可被H+所取代而形成褐色的去镁叶绿素。后者遇铜则形成绿色的铜代叶绿素很稳定,在光下不易被破坏,故常用此法制做标本;叶绿素分子的化学性质也很不稳定,易受强光破坏,特别是当叶绿素与蛋白质分离后,破坏更快。三、实验材料、试剂与仪器设备(一)实验材料新鲜植物叶片。(二)试剂95%乙醇(或丙酮)、碳酸钙、石英砂、汽油(纯净无色的)

3、、苯、醋酸铜粉末、50%醋酸、氢氧化钾甲醇溶液:20g氢氧化钾用100mL甲醇溶解,盛在具塞的试剂瓶中、醋酸铜–醋酸溶液:用50%醋酸100mL溶入醋酸铜6g,时加蒸馏水4倍稀释。(三)仪器设备天平,剪刀,研钵,漏斗,培养皿一套(底和盖直径相同),蒸发皿,滤纸条(2cm×5cm左右),圆形滤纸,蒸发皿,电热吹风机,小烧杯,试管,酒精灯,铁三角架,石棉网,移液管,滴管,玻棒。四、操作步骤1、叶绿体色素的提取和荧光现象的观察称取菠菜或其他植物新鲜叶片2~3g,去掉中脉剪碎,放入研钵中,加入少量石英砂及碳酸钙粉,加5mL95%乙醇,研磨成匀浆,再加5mL95%乙醇,提取3

4、~5min,过滤于试管中,再用3mL95%乙醇冲洗残渣。对浓的叶绿体色素提取液观察透射光和反射光的颜色,解释其原因。2、叶绿体色素的分离(1)取一张圆形滤纸(最好用色层析滤纸剪成圆形)。在滤纸的圆心戳一圆形小孔,另取一张滤纸条(2cm×5cm左右,纸条的宽度主要根据培养皿的高度确定)。用滴管吸取浓叶绿素提取液滴在纸条的一边,使色素扩展的宽度限制在0.5cm以内,用电热吹风机吹干后,再重复操作数次,然后将纸沿着长度的方向卷成纸捻,这样浸过叶绿体色素的一边恰在纸捻的一端。(2)将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中,与滤纸刚刚平齐(勿突出)。在培养皿中放蒸发皿,蒸发皿

5、内加入适量汽油和2~3滴苯,将插有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上,使滤纸的下端(无色素的一端)浸入汽油中,迅速用同一直径的培养皿盖上。此时,叶绿体色素在推动剂的推动下沿着滤纸向四周移动,不久即可看到被分离的各种色素的同心圆环。(4)待汽油将要到达滤纸边缘时,取出滤纸,待汽油挥发后,用铅笔标出各种色素的位置和名称。3、叶绿体色素的其他理化性质将本实验步骤1中提取的叶绿体色素溶液用95%乙醇稀释一倍,进行以下实验:(1)皂化作用(叶绿素与类胡萝卜素的分离)用移液管吸取叶绿体色素提取液5mL于试管中,加入1.5mL20%氢氧化钾甲醇溶液,充分摇匀。片刻后,加入5mL苯,摇匀

6、,再沿试管壁慢慢加入1.5mL蒸馏水,轻轻混匀(不要激烈摇荡),静置在试管架上,可看到溶液逐渐分为两层,下层是稀乙醇的溶液,其中溶有皂化叶绿素a和b,上层是苯溶液,其中溶有胡萝卜素和叶黄素。(2)H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用①取2支试管,第一支试管加叶绿体色素提取液2mL,作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5mL,再加入数滴50%醋酸,摇匀,观察溶液的颜色变化。②当溶液变褐色后,倒出一半于另一试管中,加入醋酸酮粉末少许,于酒精灯上微微加热,观察溶液的颜色变化,与未加醋酸铜的一半相比较。③另取醋酸铜溶液20mL左右,加入于烧杯中。取新鲜植物叶片

7、2片,放入溶液中,用酒精灯缓缓加热,观察并记录叶片的颜色变化,直至颜色不再变化为止。解释原因。(3)光对叶绿素的破坏作用①取4支小试管,其中两支各加入5mL用水研磨的叶片匀浆,另外两支各加入2.5mL叶绿体色素乙醇提取液,并用95%乙醇稀释1倍。②取1支装有叶绿体色素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片匀浆的试管,放在直射光下,另外两支放到暗处,40min后对比观察颜色有何变化,解释其原因。③另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张,通过圆心裁成两半,一半放在直射日光下,另一半放在暗中,半小时后比较两张色谱上的四种色素的颜色各有何变化。四、注意事项1、叶绿体色

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