hplc分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择

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1、HPLC分离条件的优化步骤以及定量计算公式的选择分离条件的优化定量计算公式的选择HPLC分离优化基本概念主要内容确定分离模式与色谱柱1.HPLC分离优化基本概念一、分离度与基本色谱分离方程式1、分离度——柱的总分离效能指标柱效参数：标准偏差():即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半半峰宽(W1/2):色谱峰高一半处的宽度W1/2=2.354峰底宽(W)：W=41.HPLC分离优化基本概念R=1.5，色谱图中两个相邻色谱峰达到基线分离开；R=1.0，表明两个相邻组分只有94%分离开。(最低指标）分离度表达式：R=n1/2/4•(α-1)/α

2、•k2′/(1+k2′)R受热力学因素[容量因子k′和选择性系数α（α=k2′/k1′）]和动力学因素（理论塔板数n）两个方面控制。若相邻两峰的峰底宽近似相等，令W2=W1=W，引入相对保留值和塔板数，分离度公式演变为下式：柱效项柱选择项柱容量项1.HPLC分离优化基本概念2、色谱分离基本方程式2.1、分离模式的选择2.确定分离模式与色谱柱2.2色谱柱的选择2.确定分离模式与色谱柱首选C18/C8：以15cm为佳，可解决80％的样品分析，柱效应大于50000。特殊样品用特定的柱子不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不同柱子比例会不一样。不同色谱

3、柱需合适的pH范围，一般在2.5-7.5之间，有的色谱柱比较耐碱，kromasil可以到10，而杂化xterra在1－12,XDB在pH3-11.3.1容量因子和死时间的测量在HPLC分析中，容量因子k′是一个非常重要的参数，对如何选择流动相的溶剂组成、改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作用。k′=t′R／tMt′R=tR-tM在HPLC分析中，死时间表示了一个在高效液相色谱固定相上未被滞留组分的保留时间。3.分离条件的优化1.由色谱柱的结构参数进行计算tM=Lπr2εT/F式中，L为柱长，cm；r为柱内径半径，cm；F为流动相体积流速，cm

4、3/s；εT为总孔率，对全多孔固定相为0.84，对化学键和固定相、离子交换剂为0.75，对薄壳型固定相为0.42。死时间tM的测量比较困难，有以下几种方法：3.分离条件的优化2.由色谱柱的操作参数进行计算tM=ΦηL2/△pdp2式中，Φ为阻抗因子；η为流动相的动力黏度；L为柱长；△p为柱压力降；dp为固定相粒径3.依据经验公式计算当dc/dp≥10时，可按下述公式计算tM：tM=L/u对全多孔固定相u=1.5F/dc2对非多孔固定相u=3F/dc23.分离条件的优化4.液固色谱死时间用RID（折光指数检测器）检测：若以正己烷与极性改性剂作流动

5、相，可以正戊烷作探针测死时间。用UVD（紫外吸收检测器）检测：可以苯、四氯乙烯或KNO3水溶液作探针测死时间3.分离条件的优化5.液液色谱死时间用RID检测：可以重水（D2O）、重氢甲醇（CD3OH）作探针测死时间。用UVD检测：反相可用NaCl、NaNO3、HNO3、HClO3、苯甲酸、苦味酸、尿嘧啶水溶液作探针测死时间，测量误差较大。正相可用四氯乙烯、四氟乙烯作探针测死时间。3.分离条件的优化3.2色谱柱操作参数的选择色谱柱操作参数：柱长L、柱内径Φ、柱内填充固定相的粒度dp、柱压力降△p和对应于每米柱长的理论塔板数n表示的柱效。分析型色谱

6、柱，选择操作参数的一般原则如下：色谱柱长L10~25cm；柱内径Φ（直径）4~6mm；固定相的粒度dp5~10µm；柱压力降△p5~14MPa；理论塔板数n（2~5）×103~（2~10）×104块/m3.分离条件的优化3.3样品组分保留值和容量因子的选择选择好操作参数后，通常希望完成一个简单样品的分析时间控制在10~30min之内，若为含多组分的复杂样品，分析时间控制在60min以内。保留时间和容量因子由色谱过程的热力学因素控制，可通过改变流动相的组成和使用梯度洗脱来进行调节。若使用恒定组成流动相洗脱，与组分保留时间对应的容量因子k′应保持1

7、~10之间，以求获得满意的分析结果。3.分离条件的优化对组成复杂、由具有宽范围k′值组分构成的混合物，需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组分都在最佳状态下洗脱出来。（采用梯度洗脱通常能将组分的k′值减小至原来的1/10~1/100，从而缩短了分析时间。）3.分离条件的优化3.4相邻组分的选择性系数和分离度的选择为达到某一确定分离度，选择性系数的优化十分重要，对预期柱效103~105块/m理论塔板的色谱柱，若相邻组分k在1~10，且α＞1.05~1.10，则易达到多组分优化分离的最低指标（R=1.0）选定一种高效液相色谱方法时，很难将各组分间的分

8、离度都调至最佳，只能使少数几对难分离物质对的分离度至少保持R=1.0。R＜1.0，仅呈半峰处分离，则应通过改变流动相组成或改变流动相流速，调节分离度，