dna序列测定—医学课件

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1、第八章DNA序列测定王文君广州中医药大学分子生物学技术实验室免疫研究室自然界中物种(生物)的丰富多样性是由其生命本质决定的，物种的本质特征的多样性首先体现在其DNA序列的多样性(病毒为RNA)，这种千差万别的DNA序列正是自然界中形态和功能各异的物种的基石。我们要了解各物种的本质特征，就必需从其DNA的一级结构上开始。因为其DNA的一级结构是各物种生理功能的基础，也是我们对其进行深入研究的出发点。DNA是物种生存和发展的基石一、物种的生存DNA→RNA→多肽二、物种的繁衍DNADNADNADNADNADNADNA测序方法DNA序列测定是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

2、的基础上建立起来的。可分离相差仅1个碱基的300～500bp的核酸分子。一.双脱氧末端终止法二.化学裂解法三.基因芯片法1977年，Sanger在加减法基础上提出了双脱氧末端终止法测序，其原理如下：四个反应管中，在DNA聚合酶催化下，以单链DNA为模板，加入单引物、四种dNTP，以及每管中加入双脱氧核糖核苷酸ddA、ddT、ddG、ddC。双脱氧核苷酸(ddNTP)的5’端-OH是正常的，而其3’端-OH则没有，因此能与引物延伸链的3’端连接，而不能连接其后继核苷酸，于是引物链的延伸至此结束，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据电泳图谱即可拼出所测DNA序列（即DNA的核苷

3、酸顺序）。A反应G反应T反应C反应DNA聚合酶Mg离子DNA模板引物dNTPsddATPDNA聚合酶Mg离子DNA模板引物dNTPsddGTPDNA聚合酶Mg离子DNA模板引物dNTPsddTTPDNA聚合酶Mg离子DNA模板引物dNTPsddCTPO碱基G、C、A、TCOHPOOH脱氧核糖核苷酸(dNTP)的分子结构式1’2’3’4’5’PO碱基G、C、A、TCHPO—双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)的分子结构式1’2’3’4’5’O核苷酸链示意图—磷酸—糖G—磷酸—糖—OA—磷酸—糖—OC—磷酸—糖—OT—磷酸—糖—OA—磷酸—糖—OG末端终止法图解正常双脱氧ddNTP

4、3`—ATTGCGATCTAGTGGCTAATG—5`CGCTAGATCACCGATTAC5`—TAA3`—ATTGCGATCTAGTGGCTAATG—5`5`—TAACGCTA5`—TAACGCTAG5`—TAA5`—TAA5`—TAA5`—TAACGCTAGACGCTAGATCGCTAGATCCGCTAGATCA5`—TAA5`—TAACGCTAGATCACCGCTAGATCACC末端终止法测序步骤一.测序DNA模板制备二.四种反应液的准备三.引物与模板退火四.延伸反应五.电泳六.读序DNA测序方法末端终止法：最常用。化学裂解法：研究DNA的二级结构，与蛋白质的相互作

5、用。杂交测序法：DNA多态性分析。一.测序模板的制备测序可分为单链测序与双链测序，对于未知序列可采用单链测序，而对于已知DNA序列可采用双链测序。但不管单链测序还是双链测序，其测序反应都一样。其中单链模板可通过将待测DNA片段克隆到噬菌体M13中或通过不对称PCR制备；双链模板可通过将待测DNA片段克隆到质粒DNA中或通过PCR扩增制备。所得模板DNA应通过纯化处理才能用于后继测序反应。二.测序引物的设计测序所用引物一般采用通用引物，也可根据已有序列设计引物，引物一般有15～30个碱基，应遵循一般引物设计原则。引物设计原则：1、G+C含量为45～55%。2、3端最好以A或

6、C结尾，不要以T结尾。3、引物长度以15～30bp为宜。4、引物本身不能形成二级结构。三.四种测序反应液的制备测序反应液组成：反应缓冲液、DNA聚合酶、Mgcl2、引物、纯水、四种dNTP，分别在四个反应管中加入一种相应ddNTP。标记物：测序反应的标记物有核素和荧光染料。标记载体有引物、dNTP、ddNTP。现在应用较多的是将荧光染料标记于引物或ddNTP上，因核素对环境的污染而逐渐应用得比较少。但也可以不进行标记而采用银染系统检测。四.延伸反应引物在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补配对原则逐步在引物的3’端加上四种脱氧核糖核苷酸。四个反应管中的ddNTP随机地与dNT

7、P竟争结合位点，于是引物延伸链随机终止在各个可能位点，形成一系列相差一个核苷酸的单链DNA分子。五.电泳与读序反应产物与甲酰胺混和，并高温加热变性后，于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对于没有标记的测序反应，电泳完成后可用银染将DNA标记、拍照、读序。对于用核素标记的测序反应，按核素操作规程拍照。对于用荧光染料标记的测序反应，现有一些商业生物技术公司开发的测序仪可在电泳过程中进行检测。末端终止法图示ACGTTGCACGTAA反应管AACGTTGCAACGTTGCACGTAC反应管ACACGTTGCACGTTGCACG反应管ACGACG