dotap 真核细胞转染试剂使用说明

《dotap 真核细胞转染试剂使用说明》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、北京普利莱基因技术有限公司www.applygen.com.cn电话：010-62027915,62053186Email:sale@applygen.com.cnDOTAP真核细胞转染试剂使用说明#C1510描述：DOTAP是一种阳离子脂质体，可与DNA或RNA形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放入细胞内。它以可靠性和高效性著称，是广泛使用的商品化转染试剂。我们的DOTAP真核细胞转染试剂是由DOTAP和中性辅助脂质以特定比例融合制备而成的单层脂质体悬液。这种制备方法增加了脂质体对真核细胞转染的高效性、广谱

2、性、低毒性和可靠性，并使试剂在4°C储存至少稳定12个月。DOTAP可高效转染多种细胞，甚至在低浓度血清环境也可工作良好。它属于可被生物降解的脂质体因而细胞毒性明显降低，其转染效率高于Sigma公司的DOTAP单体转染试剂，与Invitrogen的LipofectAMINE相当，但其价格仅相当同类试剂的1/3。转染时只需将稀释的DOTAP试剂与DNA溶液混合并室温放置15分钟即可加入细胞。1mlDOTAP可转染100-500µgDNA或50-100只35mm培养皿或250-1000孔24孔板细胞。颜色：清亮或略呈白

3、色胶体溶液。储存：4°C储存12个月。切勿冻存。适用：将DNA、RNA、寡聚核苷酸转入真核细胞。适用于大多数传代或原代细胞。转染步骤：以生长于24孔板的一个孔内的贴壁细胞为例，使用其它规格培养皿参见表一。细胞准备：转染前一天传0.5-2x105细胞于24孔板内，加1ml正常培养基培养。在光镜下观察细胞，当细胞群覆盖培养瓶皿生长表面的85-95%时，为DOTAP转染的最佳时机。这通常需要18-24小时，但依细胞类型和接种量而变。注意：传代时接种过多的细胞，100%长满的细胞的转化效率明显降低制备转染复合物：对特定细胞

4、类型来说，应该优化加入DNA(µg)和DOTAP(µl)比率和绝对量，参见后面附表。推荐DNA和DOTAP的初始比例为1:4。DNA(µg)：DOTAP(µl)＝1:2～1:8转染实际上是人为造成细胞对外源物质的高摄取状态，因此过量摄入DNA和转染试剂将导致细胞毒性而降低转染效率。与细胞接触的转染混合物中DOTAP的最大浓度不应超过30µl/ml，DNA浓度应小于5µg/ml。参考表一制备转染复合物，参照表二进行优化。下面的步骤以生长于24孔板的单孔贴壁细胞为例。悬浮细胞转染参见表一后面的说明。1.取1µgDNA稀

5、释到25µl无血清无抗生素培养基，混匀。2.取2-8µlDOTAP加入到25µl无血清抗生素培养基，轻轻混匀。3.吸取稀释的DNA溶液加入到稀释的DOTAP溶液中，上下吹吸混匀，勿振荡。室温孵育15分钟。如果按照相反的顺序将稀释的DOTAP溶液与DNA混合，将生成相反类型的DNA转染复合物，有可能会导致转染效率下降。4.在此期间用无血清培养基洗涤细胞1-2次，按照表一Step5加入适宜体积的无血清无抗生素培养基。5.加入步骤3获得的转染复合物于培养瓶皿内，轻轻混合与细胞充分接触，开始转染细胞。6.二氧化碳孵箱37C

6、孵育细胞4小时。7.吸除转染混合物，加入含血清的正常培养基；或直接将含血清培养基加到孔内，继续培养24小时以上。观察细胞，进行下一步实验。或1:10稀释传代，进行G418筛选。Page2of2ApplygenTechnologiesInc.北京普利莱基因技术有限公司www.applygen.com.cn电话：010-62027915,62053186Email:sale@applygen.com.cn表一DNA和转染试剂稀释表Step1Step2Step3Step4Step5CultureVesselAreacm2

7、CellNo.DiluteDNA(µg)tomedia(µl)DiluteDOTAP(µl)tomedia(µl)DOTAP:DNAmixtureSerum-freemediainwellTotalTrans.volume96-well0.31´1040.2µgin10µl0.5µlin10µl20µl80µl100µl48-well15´1040.5µgin20µl2µlin20µl40µl100µl140µl24-well21´1051µgin50µl4µlin50µl100µl200µl300µl12-wel

8、l42´1052µgin100µl8µlin100µl200µl400µl600µl6-well105´1054µgin250µl15µlin250µl500µl1000µl1.5ml35-mm105´1054µgin250µl15µlin250µl500µl1000µl1.5ml60-mm301´10610µgin500µl40µlin500µl1000µ