医药学医学毕业论文 基因的染色体定位

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1、湖南师范大学本科毕业论文考籍号：XXXXXXXXX姓名：XXX专业：医药学医学论文题目：基因的染色体定位指导老师：XXX二〇一一年十二月十日关键词：基因定位荧光原位杂交放射杂交体　　在人类基因组计划（HGP）中有二大部分内容，一是在2005年之前完成对人类基因组DNA约3×109个核苷酸序列的测定，同时完成对基因的染色体定位工作；二是开展基因功能的研究。基因定位与基因序列两者相辅相成，基因染色体的定位既有助于基因序列的测定，又有利于对基因结构和功能的研究，有利于进一步提示生物的遗传信息。基因测序技术，尤其是大规模测序技术的建立，极大地提高了基因测序

2、的速度。到1999年1月25日为止，全世界已测出全部人类基因序列的7.3%，而部分生物，如酵母、大肠杆菌等的序列已全部测定完毕，这样cDNA的染色体定位工作就显得尤为迫切。然而由于目前的基因大规模测序是建立在基因定位的基础之上，而基因组的染色体定位（基因作图）工作跟不上基因测序技术的发展，因而成了限制基因序列测定的主要因素。基因的染色体定位方法多种多样，它可分为基因的遗传作图和物理作图，而物理作图中最主要是荧光原位杂交（FISH）和放射杂交体（RH）二种。本文就目前主要的几种基因作图方法作一介绍。　　1荧光原位杂交（FISH）　　原位杂交（ISH）

3、原早被用于染色体组型和核酸分布的分析，后来，随着技术的发展，它被用于基因染色体定位的研究，特别是非同位素标记技术的发展，使得ISH的应用日前广泛。目前它已被用于肿瘤的细胞遗传改变、人类的早期发育、核与基因组的分子结构、不同种属间的基因图谱比较、动物的细胞发生和无数的基因定位研究。用于基因染色体定位的FISH已被称为CO-FISH或COD-FISH（chromosomeorientationanddirectionFISH）[1]。　　CO-FISH技术是以生物素或地高辛等半抗原为标记物，采用随机引物法或缺口平移法标记DNA探针，将探针变性后即可用于

4、细胞分裂中期或间期细胞核染色体的原位杂交并产生DNA-DNA杂交体，这种杂交体可以被与半抗原有高度亲和力的荧光标记分子所检测到，而这种杂交信号又可以被与荧光分子偶联的单抗所放大。此外，DNA探针也可以直接标以荧光分子，这些荧光分子有：FITC、德克萨斯红（texasred）及最近开发的花青染料（cyaninedyes）等，如果这样，就不需要进行信号检测和放大就可以直接观察DNA-DNA杂交体[2]。用于FISH的DNA底物已经由原先固定的染色体和间期细胞核发展到伸展的单链DNA分子、细胞核及染色体的自然形态等[3]。由于FISH技术已经可以在伸展的

5、DNA分子上进行，这样它的分辨率就达到1～2kb，并能在此区域内作图。而传统的在细胞中期和间期进行的FISH只能分别分辨1～5Mb和50kb左右的区域，分辨率的提高使得更详细的基因结构和基因内重排研究成为可能；FISH对自然状态下细胞和染色体的研究可以阐明核成分的分布并且不会出现象计算机三维重建分析时的干扰现象；同时，还能对二条同源染色体转录活性的核功能进行研究，并可直接观察基因表达过程中核成分的位置。FISH不仅能对固定的标本进行研究，还能对新鲜的标本进行研究，更有报道认为它能分辨单一碱基的替换[4]。　　用于基因定位的FISH技术经历了从用洗涤

6、剂或碱裂解液处理细胞核产生伸展状染色质，从机械拉展染色质到分子梳，再到最近的动态分子梳技术(dynamicmoleularcombingDMC)[5]。DMC技术是分子梳技术和荧光杂交技术的结合，它分为四个步骤：①制备三氯硅烷包被的玻片；②从低熔点琼脂糖胶中制备DNA溶液；③将玻片浸于溶液里5分钟，使DNA结合到玻片上；④用300μm/s的速度将玻片从溶液中抽出。由于在玻片-溶液界面处，浸在溶液中的部分对已抽出部分有一种持续的回复力，加上它们的疏水性，硅烷的表面很快就干燥，使得被拉长的DNA纤维不可逆地被固定于玻片表面，这种DNA纤维呈平等状、单方

7、向分布，似梳子状。整个表面的伸展是均一的（2kb/μm），它不受DNA片段大小的影响。与其它方法相比，DMC技术有如下优点：①在整个平面的伸展可使杂交信号为单一信号，无需标化。②不同的表面和不同的溶液中DNA的伸展无变化。③高密度的基因组DNA和杂交信号可使统计分析在一张22×22mm的载玻片上即可进行。④一定的DNA断裂可产生持续的可分析数百kb的DNA片段。⑤可从同一种DNA溶液中制备出许多伸展平面。　　2放射杂交体法（RH）　　尽管FISH技术可以对基因进行染色定位，但是从分子角度来看，它的定位工作仍显得较粗糙，它只能将基因定位于百万个碱基的

8、范围（2%的染色体长度）。因此发展一种较敏感的技术势在必行。RH就是在这样的情况下产生的，它的基础是Goss和Harris