实验八培养液及用液配制与消毒

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1、实验八培养液及用液配制与消毒1、培养液种类（medium）血清（FBS，FCS，CS，HS）合成培养基如:EagleMEM、DMEM、PRMI1640、HamF12等无血清培养基（serumfreemedium）一、培养液及用液的种类2、培养用液1）水与平衡盐溶液培养用水缓冲溶液生理盐水平衡盐溶液（BSS）如：PBS、Hank’s、D-Hank’s液2）其他培养用液消化液：胰蛋白酶液、EDTA液抗生素：青链霉素pH调整液：HEPES液、NaHCO3谷氨酰氨液冻存液：用DMSO和培养液配制二、细胞培养用液的要求及成分水：新

2、鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml细胞生长条件培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。1）天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染细胞生长条件2）合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量

3、，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。细胞生长条件人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子；⑥转移蛋白；⑦不明成分。细胞生长条件一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可

4、以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10％血清．血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟。血清的消毒：过滤除菌。细胞生长条件消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过

5、滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。细胞生长条件抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定。细胞生长条件基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100单位／毫升完全培养基的组成细胞生长条件RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000m

6、l过滤除菌，调节pH值至7.2加血清（终浓度10％）。三、培养基的配制细胞生长条件1、滤器准备清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0．22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20min进行高压灭菌处理。在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。过滤后要检查滤膜是否完好无损。2、配制步骤1．准备超纯水或三蒸水。2．加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间(2—4h)使之充分溶解。3．配制RPMll640培养基时应通入适量C02或加入6mol／L盐酸调pH至6．0左右，这样才能

7、充分溶解。4．加入一定量NaHCO，调节pH至7．0左右。5．加水至最终体积。6．在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。7．瓶口封好，4℃冰箱贮存。四注意事项1．过滤时压力不要太大，以压力数字2为宜，否则细菌易滤过达不到除菌效果，或使滤膜破裂。2.分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中(分装量为使用3~5次用完为宜，并且每瓶只能装2／3体积的液体，过多时瓶子易爆或胶塞自喷)。3.滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。