资源描述：
《细胞培养用液的配制与消毒》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、细胞培养用液的配制与消毒一、器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋口酶，青霉索、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。具体步骤：(1)水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离了和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.(2)PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如：Hanks,D-Hanks液的配制)：1.溶解定容：将药品(NaCI8.0g,KCI0.2g,Na2HPO4H2O1.56g,KH2PO40.2g)倒入盛冇双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶(大的
2、吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸饰水补充蒸发掉的水份。⑶胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作川是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37°C吋，胰醐溶液的作用能力最强。使用胰醐吋，应把握好浓度、温度和吋间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg?+和血清、蛋门质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者耽酶抑制剂终止肌酶对细胞的作用。1
3、.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电了•天平准确称取粉剂溶入小烧杯屮的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4C内过夜。2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酚溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于・20°C保存以备使用。(4)青、链霉素溶液的配制于消毒1.所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。2具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射辭加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，力口5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。1.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为
4、100单位/mb1单位=1微克(4)RPMI1640的制备与消毒：1•溶解、调PH值、定容：先将培养族粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中，并川双蒸水冲洗包装袋2・3次(冲洗液•并加入培养基屮)，充分搅拌至粉剂全部溶解，并按照包装说明添加…泄的药品.然后用注射器向培养基小加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉索的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当呈:的盐酸和NaOH调PH至Q7.2左右。最后左容至1000ml,摇匀。2安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，川螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。1.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡
5、式滤器在超净工作台内过滤。2.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4°C冰箱内待用。3.使用前要向100ml培养液屮加入1ml谷氨酰胺溶液(4°C时两周有效)。(5)血清的灭活：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56°C水浴屮火活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。(6)HEPES溶液：HEPES的化学全称位疑乙基呱嗪乙硫磺酸(N,-a-hydroxythylpiperazine-N,-ethanesulfanicacid)。对细胞无毒性作用。它是一种氢离了缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,-般培养液内含20mmol/LHEPES即可达
6、到缓冲能力。1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下:准确称取HEPTS238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4°C保存。注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况杲活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。(7)谷氨酰胺：合成培养基中都含冇校大量的谷氨酰胺，其作川非常重要，细胞需要谷姐酰胺合成核酸和蛋口质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞牛长不良甚至死广。在配制各种培养液中都应该补加一•定量的谷氨酰
7、胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳左，4°C下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于・20°C冰箱中保存，用丽加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4°C冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1〜4mmol/Lo可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶
