酸性蛋白酶生产工艺

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1、第六节酸性蛋白酶生产工艺0704064247李继江1蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶1.1蛋白酶的定义蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。1.2微生物蛋白酶分类微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。酸性蛋白酶为近乎白色至

2、浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。1.3蛋白类酶蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。1.4酶的生产方法酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下

3、发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。1.5　酸性蛋白酶制剂的性能1.5.1酸性蛋白酶的作用机理　　酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）水解动植物蛋白质，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。1.5.2pH对酶活及酶稳定性的影响　　酸性蛋白酶稳定pH范围2.0～4.0之间，最适pH2.5，p

4、H低于2．0、高于4．0将影响水解速度。1.5.3温度对酶活性及稳定性影响　　酸性蛋白酶适宜温度范围30℃～50℃，最适作用温度为50℃，低于40℃酶活稳定，超过50℃，酶活性损失严重。1.5.3金属离子对酶活力的影响　　酸性蛋白酶可被Mn2＋、Ca2＋、Mg2＋离子激活，被Cu2＋、Hg2＋、Al3＋离子抑制，液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中失活较多。1.5.4酸性蛋白酶制剂酶活力定义　　酸性蛋白酶活力是指1克固体酶粉或1ml液体酶，在45℃左右和pH2.5条件下，1分钟水解酪酸蛋白产生1微克酪氨酸即为一个酶活力单位

5、。酸性蛋白酶45℃酶活为50138左右。2酸性蛋白酶的生产2.1生产菌株的选择目前已经用于生产酸性蛋白酶的微生物菌株有：黑曲霉、米曲霉、拟青霉、啤酒酵母、乳酸杆菌、枯草杆菌等，其中以黑曲霉为主，这些曲霉产生的蛋白酶有一定的耐酸性和耐热性。我国生产酸性蛋白酶的菌株有黑曲霉AS3.301，AS3.350等。黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌，菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。黑曲霉可以用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶，主要用于酸性蛋白酶等的生产。2.2发酵培养基产酸性蛋白酶

6、的微生物，它们的发酵培养基都基本选择麸皮、米糠、玉米粉、淀粉、饲料鱼粉、豆饼粉、玉米浆等各种碳氮源，按各种不同比例混合，添加无机盐配成各种培养基。C源：蛋白酶的生产既受分解代谢产物阻遏也受底物的诱导。葡萄糖等容易利用的碳源常可引起分解代谢阻遏使产酶降低，因此通常用大麦粉、玉米粉、淀粉，有时也用麦芽糖做碳源。黑曲霉生产酸性蛋白酶时利用玉米粉作为碳源。N源：黑曲霉生产酸性蛋白酶时需要较高浓度的氮源浓度，在有机氮存在时，NH4+或NO3-对黑曲霉生产酸性蛋白酶有显著促进作用。故一般采取高浓度的有机氮并辅与浓度为1%--3%的

7、无机氮。有机氮常用蛋白胨、豆饼粉、鱼粉的石灰水解物等。无机盐：磷酸盐对微生物蛋白酶的生产很重要。磷酸盐对微生物蛋白酶的生产很重要，使用麸皮、米糠等含磷较丰富的原料时，添加磷酸盐对产酶具有促进作用，在黑曲霉3.350酸性蛋白酶的生产培养基中添加0.1%~0.3%的磷酸盐可使酶活性提高20%~30%。Ca2+对某些菌株产蛋白酶具有很大影响，培养基中添加0.5%CaCl2黑曲霉3.350酸性蛋白酶的产量会提高40%左右。其他成分：向培养基中添加适量表面活性剂可以改善细胞膜的通透性或诱导酶的生成，在一定条件下可显著促进蛋白酶的生

8、产。下面列出的是黑曲霉3．350发酵培养基的配方：　　玉米粉6％豆饼粉4％　　玉米浆0.6％氯化铵1.0％氯化钙0.5％磷酸二氢钠0.2％　　豆饼石灰水解液10％2.3发酵条件控制（1）接种量：适当控制接种量对菌株产酸性蛋白酶的活力关系很大。一般接种量为5%~10%，且有研究表明5％的接种量比10％的接种量要好。（2