蛋白质双向电泳过程与体会

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1、蛋白质双向电泳过程与体会双向电泳IEF(sigma)IEF（notIPG）/SDS-PAGE最简单的装备推荐如下，适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓的，嘻嘻！IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不推荐），SDS-PAGE用六一厂的就可以了（ft，六一厂应该给我money吧，给你做广告了)(money不是很多的强烈推荐六一的，买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧，呵呵）BIO－RAD的圆盘电泳槽，国产的不推荐，因为上槽Biorad的铂金丝凹进去了一点，不是很进去，而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈，影响电聚焦。

2、双向电泳蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%

3、SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存2蛋白质浓度测定按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl水及50μl20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离

4、心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μlPBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做2.3.1电聚焦（IEF）2.3.1.1玻管准备干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M的NaOH泡至少1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3次水;后用2M的HCL泡至少

5、1个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1个小时，中间换3，4次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里面1hr，轰干就可以用了.2.3.1.2凝胶制备与电聚焦灌IEF的配方为3.09克尿素1.125ml10%NP-401.125ml水0.735ml30%屏息现案(ACR28.38BIS1.62)0.15mlAm3.5-100.375mlAm5-78卫生10%AP1.8卫生TEMED用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，

6、我一般是头天下午灌胶，第2天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50mmol/LNaOH至管口,不要破坏样品与NaOH的界面。即可进行电泳。电极液为：上槽（负极）为50mmol/LNaOH液，下槽（正极）为25mmol/LH3PO4。按200V×15min，300V×30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V17hr1000V2hrveryimportantthingis跑第一向一定要在保持在37度左右,特别是冬天,我的方法是温控仪控制暖风机在37度暖风机和电泳槽在一个大

7、的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好.2.3.1.3电泳后的凝条处理电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱想哭却又哭不出来，呵呵，熟悉了就快了，注射器枪头玻璃管必须为一直线，消息不要把注射器的头搞断了。取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm的小段，各自浸入含1.3ml抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日