免疫组化4--双重或多重标记

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1、双重或多重免疫组化标记一、基本原理双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上原位示踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一项标记染色技术。示踪剂：---荧光素---酶---胶体金等操作的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同优点：不同抗原成分位置、功能关系更直观缺点：流程长脱片机率更高前后重染色试剂间有交叉干扰二、技术类型（一）双重或多重免疫荧光标记染色采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。优点：方法敏感、特异缺

2、点：需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影样本不能长期保存组织结构背景不清晰。直接法---特异、快速间接法---敏感、多用技术类型抗体试剂异种动物抗体---常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低同种动物抗体---分别应用，操作步骤加倍，脱片机率较高；前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH双重免疫荧光标记染色（间接法）(1)石蜡切片，脱蜡，梯度酒精水化，入PBS。(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育(4)

3、0.05mol/LTBS洗(5)羊抗鼠IgG-TRITC，避光反应1h。(6)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(第一重ACTH-TRITC标记染色已完成)。(7)切片脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在80℃烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。(8)切片以TBS洗(9)1％HSA孵育30min(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗(12)羊抗鼠IgG-FITC，避光反应1h。(13)0.05m

4、ol/LTBS(pH7.4)洗(第二重GH-FITC标记染色完成)。(14)缓冲甘油封片。(15)荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察切片组织内TRITC及FITC所标示的ACTH及GH抗原（TRITC阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色）。(16)用彩色底片对切片同一部位用546nm及490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的ACTH与GH两种抗原。TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游离FabTTTFGH抗原ACTH抗原FF

5、ab被灭活图1同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理（二）双重或多重免疫酶标记染色以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。优点：光镜下可以同时观察和对比一次曝光即可成像样品保存时间相对较长★常用标记酶与底物的配伍单酶双底物DAB(棕色):4CN(蓝色)AEC(红色):4CN(蓝色)坚固红(fastred红色)坚固蓝(fastblue蓝色)HRPAP-萘酚AS-MX双酶双底物HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-坚固蓝)HRP(4CN):AP(萘酚AS.M

6、X-坚固红)直接法、间接法、桥法均可使用灵敏度以桥法中的复合物法最高特异性则以直接法最佳操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合物法之分。间接法与复合物法较常采用。★操作举例淋巴瘤轻链κ、λ的双重酶标记（双酶双底物）(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液脱汞5min，乙醇浓度为70％，经自来水洗后，以2.5%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片30min,自来水洗，蒸馏水洗,入PBS(0.01mol/LpH7.2);(3)滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，10

7、min，不洗；(4)加一抗(抗人κPcAb与抗人λMcAb的混合液)1:200，湿盒，37℃，45min或更长；(5)PBS液，5min×3(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，温盒，37℃，30min；(7)PBS洗，5min×3;(8)加酶抗酶抗体复合物(兔PAP＋鼠APAAP混合液1:100)，湿盒，37℃，30min；(9)PBS洗，5min×3；(10)过氧化物酶显色反应：以DAB-H2O2液显色7～10min(镜下控制显色程度)，PBS洗，5min×3；(11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX及坚固蓝(f

8、astblue)显色10～15min(镜下控制显色程度)，PBS洗、自来水洗；(12)缓冲甘油封片，光镜下观察PPPAAAκλ图2双酶双底物(复合物法)双重酶标染色原理兔PAPGARIgG兔抗KAg鼠APAAPGAM.I