crispr及其在原核生物防御系统中作用的研究进展

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1、CRISPR及其在原核生物防御系统中作用的研究进展摘要近来在众多原核生物的基因组的分析中，发现一类成簇的、有规律间隔的短回文重复序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）结构家族。CRISPR由一类DNA重复单元所构成，在功能上与DNA的重组、修复及原核生物的免疫防御系统关系密切。通过对于CRISPR及其相关系统（CASs）基因的比较性分析，CRISPR独特的结构和功能引起人们的广泛关注。实验表明CASs的插入序列来源于细胞内的许多染色体外遗

2、传物质，并且以一种类似于真核生物中RNA干扰（RNAi）系统的机制，在原核生物抵抗入侵的噬菌体和质粒的防御系统中发挥着重要作用。本文综述了CRISPR系统的基本结构、多样性、作用机理及其区分自我与非我的机制，并对CRISPR研究和应用前景进行了展望。关键词：CRISPR；原核生物；免疫成簇的规律间隔的短回文重复序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）是一类独特的DNA直接重复序列家族，广泛存在于众多原核生物基因（大多数的细菌和几乎所有的古细

3、菌）中[1]。自2002年首次被人们所定义以来，CRISPR一直以其奇特的结构与特殊的功能吸引着各国科学家们的共同关注。它的结构非常稳定，长度约25～50bp的重复序列（这里我们称为repeats）被单一序列（这里我们称为spacers）间隔[2]。根据不同的研究结果，人们对CRISPR系统的生物学功能曾有过种种推测，最近人们发现Cas系统（CRISPR-associatedsequencessystem，CASs）在原核生物中表现出某种获得性免疫功能，帮助细菌抵御病毒的侵犯，并和DNA的重组与修复有关[3]。2005年，3

4、个研究小组分别发现一些CRISPR的间区序列是来自噬菌体或质粒等染色体外的序列，据此推断CRISPR系统能使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力[4-6]。2007年，Barrangou等[7]通过实验证实了CRISPR系统的这一生物学功能。1CRISPR系统的基本结构随着细菌基因组学的发展，CRISPR的基本结构已逐渐被确定，由短的高度保守的repeat与长度相似的非重复的spacers序列间隔排列[11]所组成（图1-A）。Repeats是一组高度保守的短小序列，其长度一般为25至50个碱基对。Spacer

5、s与repeats的长度相近，约为26到72个碱基对。此外一组约由4～10个保守基因组成的序列被发现于CRISPRs周围，我们称之为CASs（CRISPR-associatedsequences，CASs）[11]。在CAS蛋白中已鉴定出核酸内切酶、核酸外切酶、螺旋酶、RNA-和DNA-结合等结构域，因此，认为CAS蛋白参与CRISPR的转录、加工和外来基因序列的降解等过程[3]。图12CRISPR统的广泛分布和多样性在已测序的约40%细菌和90%古细菌基因组中至少存在1个CRISPR座位(locus)，古细菌詹氏甲烷球菌(

6、Methanocaldococcusjannaschii)中存在18个CRISPR座位，是目前已研究的原核生物中最多的[8]。每个CRISPR座位具有几个到几百个R-S重复单位(图1-A)，平均为66个，目前记录最高的是Chloroflexussp。Y400fl(4个CRISPR座位中的1个具有374个R-S重复单位)和Verminephrobactereiseniae(249个)[2,8]cas基因多达45个家族[9]，根据CAS蛋白的序列同源性、组成情况和功能，可将CRISPR系统分为8个亚型:Ecoli、Ypest、N

7、meni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube，各亚型通常具有2－6个亚型特异的cas基因，在没有CRISPR系统的基因组中则不存在相关基因[8]。cas1－cas6这6个家族广泛存在于不同的CRISPR亚型，被认为是核心cas基因，其中只有cas1和cas2家族存在于所有的CRISPR亚型，因此，cas1和cas2家族基因也被用作鉴定CRISPR系统的分子标记[10]。此外，间区序列(S)也具有极其丰富的多样性，Horvath等[12]在嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)

8、的124个菌株中发现了3626个间区序列，分布在3个CRISPR座位，其中，77%、16%和7%的S序列分别与噬菌体、质粒和嗜热链球菌基因组序列具有同源性。在Bacillusthuringiensis菌YBT-1520和CT-43菌株的染色体上均没有鉴定出CRISPR系统，而在YBT-15