人rorγt mrna实时荧光定量pcr检测方法的建立及初步应用

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1、人RORγtmRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用作者：王海生王胜军崔大伟陈建国柳迎昭　杨先知史烨田洁仝佳许化溪【摘要】目的：建立检测人RORγt(retinoidrelatedorphanreceptorgammat)mRNA的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qRTPCR)方法。方法：根据人RORγtmRNA的保守序列设计特异性引物，提取经PMA和离子霉素刺激的人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononu

2、clearcell,PBMC)总RNA，并逆转录成cDNA，与pMD18T载体连接构建质粒标准品。采用qRTPCR方法检测RORγtmRNA水平，并评价该方法的线性、特异性及重复性。应用该方法检测Graves病(Graves′disease,GD)患者外周血中RORγtmRNA的相对表达。结果：该方法标准曲线的相关系数为0.998，融解曲线分析显示单个峰，pMD18TRORγt质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为6.5%，8.4%和9.6%，11.2%。初步研究表明GD患者组RORγtmRNA的相对表达

3、水平明显高于健康对照组(t=-3.72,P<0.01)。结论：建立的检测人RORγtmRNA的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异且重复性好，为临床应用提供了实验基础。【关键词】RORγt;实时定量PCR;SYBRGreenⅠ11　　[Abstract]Objective:ToestablishaSYBRGreenⅠrealtimefluorescentquantitativePCR(qRTPCR)methodforthedetectionofhumanRORγt(retinoidrelate

4、dorphanreceptorgammat)mRNA.Methods：ThespecificprimersweredesignedaccordingtotheconservedsequenceofhumanRORγtmRNA.TotalRNAwasextractedfromhumanperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)stimulatedbyPMAandionomycin,andwastranscribedreverselyintocDNA.TheRORγtgenewasobtain

5、edbyPCRandclonedintoPMD18vectorbyTAclonetechnology.Thelinearity,specificityandrepeatabilityofthemethodwereevaluated.TherelativeexpressionlevelofhumanRORγtmRNAinPBMCsfrompatientswithGDwasdetectedbythismethod.Results：Thecoefficientofcorrelationofthestandardcurveof

6、thismethodwas0.998,meltingcurvewassinglepeak,andtheCVsinintraandinterassaywere6.5%,8.4%and9.6%,11.2%inhighandlowcopiesplasmidstandardsrespectively.TherelativeexpressionlevelofhumanRORγtmRNAinGDgroupwashighermarkedlythanthatinhealthycontrolgroup(t=-3.72,P<0.01

7、).Conclusion：qRTPCRwasasensitive,specificandrepeatablemethodforthedetectionofhumanRORγtmRNA,andthismethodservesasatechnologicbaseforclinicalapplication.11　　[Keywords]retinoidrelatedorphanreceptorgammat;realtimequantitativePCR;SYBRGreenⅠ　　RORγt(retinoidrelated

8、orphanreceptorgammat)基因是RORC的一种剪接变异体，最初因主要表达在CD4+CD8+胸腺细胞而得名[1]。近期研究表明Th17细胞在炎症反应及自身免疫病等疾病中发挥了重要作用，RORγt作为Th17细胞特异性转录因子可诱导IL17A，IL17F等因子的表达[2]。本文建立了一种检测人RORγ