化痰活血软坚法对肾小球硬化大鼠肾组织mmp-2、timp-2的影响

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1、化痰活血软坚法对肾小球硬化大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2的影响【摘要】目的探讨化痰活血软坚法防治肾小球硬化的作用机制。方法以化痰活血软坚方对肾小球硬化大鼠进行干预，用SABC法和原位杂交法检测大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2、TIMP-2mRNA的表达，运用图像分析软件对结果进行半定量分析。结果化痰活血软坚方对模型大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2、TIMP-2mRNA的表达均有显著促进作用，且使显著下降的MMP-2/TIMP-2比值明显回升。结论化痰活血软坚法调整MMP-2与TIMP-2之间的动态平衡是其防治肾小球硬化的重要机制。【关键词】化痰

2、活血软坚法；肾小球硬化；MMP-2；TIMP-2基质金属蛋白酶系统（MMPs）是促进细胞外基质（ECM）降解的主要酶系，与肾小球硬化密切相关。化痰活血软坚法是根据肾小球硬化的病理特点、发生机制以及中医对其病因病机的认识并结合中西医药防治肾小球硬化的经验而确立的治疗方法，依据治法笔者自拟处方进行了初步实验研究，结果显示对肾小球硬化有很好的防治作用。为探讨该法的作用机理，对其影响肾小球硬化模型大鼠肾组织MMP-2及其抑制物TIMP-2表达的作用进行了观察。现报告如下。1材料与方法61.1实验材料1.1.1实验动物Wistar大鼠，雄性，体重180～200ｇ

3、，山东大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鲁）20030004。1.1.2药物与试剂化痰活血软坚方由海藻、丹参、大黄、黄芪、当归组成。水煎两次，大黄后入，滤取药液合并，减压浓缩（80℃）为0.4g/ml，低温保存备用。使用前放至室温并摇匀。亲和纯化兔抗MMP-2多克隆抗体、亲和纯化兔抗TIMP-2多克隆抗体、生物素化山羊抗兔IgG、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、TIMP-2mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。盐酸多柔比星深圳万乐药业有限公司生产，批号:0103Ｅ1，使用时以生理盐水稀释成1ｍｇ/ｍｌ的溶液。1.2实验

4、方法1.2.1实验动物分组将大鼠随机分为正常组10只、模型组15只、中药组15只，自由饮水进食，1周后进行实验。1.2.2模型制备大鼠称重，腹腔注射0.2ml6/100g体重1.75%戊巴比妥钠生理盐水溶液麻醉。从背部摘除左肾，缝合伤口。正常组行假手术，不摘除肾脏，余与上同。手术1周后，大鼠第一次尾静脉注射阿霉素5mg/kg体重，手术5周后第二次注射阿霉素3mg/kg体重。正常组尾静脉注射等量生理盐水。1.2.3给药第一次注射阿霉素1周后，中药组灌胃给药1ml/100g体重，正常组和模型组给予等量蒸馏水。连续给药12周。实验过程中模型组6只死亡，中药组

5、死亡4只。1.2.4标本的收集与处理摘取右肾，迅速冠状切开，分别以10%甲醛和4%多聚甲醛（DEPC水配制）固定，石蜡包埋。甲醛固定组织切片厚度4μm，多聚甲醛固定的组织切片厚度6μm。1.2.5肾组织MMP-2、TIMP-2免疫组化检测采用SABC法检测，兔抗大鼠MMP-2抗体和兔抗大鼠TIMP-2抗体1:100倍稀释，PBS代替一抗作为阴性对照。OLYMPUSBX41光学显微镜观察，每张切片任选10个肾小球，OLYMPUSC-4000ZOOM数码相机照相（光亮度设定一致），用Image-proplus4.5图像分析软件对结果进行半定量分析，每张切片

6、随机选取10个视野，测定10个视野的积分光密度，以均值作为该样本MMP-2、TIMP-2的相对表达量。1.2.6肾组织TIMP-2mRNA检测采用原位杂交法。结果分析同上。1.3统计学分析数据以均数±标准差（x±6s）表示，数据统计以SPSS11.0统计分析软件进行单因素方差分析。2实验结果模型大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2、TIMP-2mRNA表达均减弱，且MMP-2/TIMP-2比值下降，差异有显著性（P＜0.01）。化痰活血软坚方干预后模型大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2、TIMP-2mRNA表达显著增强（P＜0.01）。从MMP-2与TI

7、MP-2的比值看，模型大鼠MMP-2/TIMP-2数值下降显著（P＜0.01），化痰活血软坚方使二者比值明显回升（P＜0.01）。结果见表1、表2。表1对肾组织MMP-2、TIMP-2的影响：与模型组比较，※P＜0.01表2肾组织TIMP-2mRNA的表达注：与模型组比较，※P＜0.013讨论基质金属蛋白酶家族（MMPs）是一组可降解ECM的酶，是肾脏内主要的基质降解酶体系，其表达量及活性的高低直接影响着肾小球ECM的表达量和在局部的沉积。研究事实证明，MMPs活性下降是导致ECM成分在肾小球内不断积聚，从而导致肾小球硬化的重要机制之一。MMP-2属于

8、MMPs家族的明胶酶类，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ6型胶原。现已证实肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细