iga肾病小鼠肾组织鞘氨醇激酶、 内皮分化基因表达及意义

《iga肾病小鼠肾组织鞘氨醇激酶、 内皮分化基因表达及意义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、IgA肾病小鼠肾组织鞘氨醇激酶、内皮分化基因表达及意义作者：程军,张雯,陶筱娟,方鲁,于健宁【摘要】　　目的:探讨鞘氨醇激酶(SPK)与磷酸鞘氨醇(SPP)受体EDG3、EDG5在IgA肾病（IgAN）小鼠肾皮质中的基因表达情况。方法:复制IgAN小鼠模型,应用实时荧光定量PCR检测肾皮质SPK与SPP受体EDG3、EDG5的mRNA表达。结果:IgAN小鼠肾皮质中SPK与SPP受体EDG3、EDG5的mRNA均高表达,其中SPK与α平滑肌肌动蛋白（αSMA）成正相关。结论:在IgAN肾组织中,SPK、EDG3及ED

2、G5可能在系膜细胞的增殖和发生表型改变的信号转导过程中发挥着重要作用。【关键词】IgA肾病鞘氨醇激酶荧光实时定量PCR　　鞘氨醇激酶(sphingosinekinase,SPK)是细胞内合成1磷酸鞘氨醇(sphingosine1phosphate,SPP)的主要限速酶,同时也是重要的细胞信号转导分子。SPP是新近发现具有重要生理功能的另一种膜磷脂代谢产物。SPP与神经酰胺、鞘氨醇之间在细胞内的代谢平衡决定着细胞的生存与死亡,多种生长因子可激活细胞内SPK,SPP合成增加,从而可拮抗神经酰胺引起的细胞凋亡以及产生其他多

3、种生物效应[1],如刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡、调节细胞的形态分化等,9SPK是调控三者之间平衡的关键酶[2]。最近发现SPP刺激肾脏系膜细胞的增殖[3,4],细胞外SPP激活系膜细胞主要是通过膜受体EDG3/EDG5/蛋白途径,促进系膜细胞增殖。IgA肾病（IgAnephropathy,IgAN）是我国发病率最高的系膜增殖性肾病,Katsuma等[5]在HIGA小鼠（一种自发IgAN模型）中发现SPPEDG5通路在系膜细胞增殖过程中起着重要作用。本研究中选用小鼠IgAN模型,运用实时荧光定量PCR检测了肾皮质SPK及

4、其EDG3、EDG5表达,发现IgAN小鼠肾皮质中SPK及其EDG3、EDG5均存在高表达,而且SPKmRNA与αSMAmRNA表达成正相关。　　1材料和方法　　1.1材料清洁级BALB/c系雌性小鼠（质量10±30g）,由浙江大学实验动物中心提供,尿检潜血及蛋白均阴性。动物房温度控制在（23±5）℃,相对湿度（60±15）%,噪音低于55分贝。总RNA提取试剂为TRIzol为Gibco公司产品,反转录试剂盒SuperscriptTMⅡRnaseHReverseTranscriptase为Invitrogen公司产

5、品,DNA纯化试剂盒购自申能博彩公司,含SYBRGreenⅠ的PCRMasterMix为BioRad公司产品。凝胶成像系统AlphaImagerTM2200,为AlphaInnotech公司产品,电泳仪和iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统为BioRad公司产品。9　　1.2方法　　1.2.1动物分组与造模雌性BALB/c小鼠16只随机分2组:正常组、模型组,每组8只。正常组以新鲜煮沸后冷却后的蒸馏水为日常饮用水;模型组按照文献报道诱导IgAN小鼠模型[6,7],以1g/L牛血清丙种球蛋白（BGG,上海晶

6、美公司）,并以6mmol/L稀盐酸酸化（采用新鲜煮沸冷却后的蒸馏水中加盐酸的方法,每500mL加100mL/L盐酸1.6mL配制）密闭冷却后作为代替日常饮用水。于第8周尾静脉注射1mgBGG连续3d,第10周断颈处死,并剥离肾脏,右肾快速取出随即置于-70℃低温冰箱保存,以备PCR应用。　　1.2.2尿蛋白定量实验第10周,用小鼠专用代谢笼收集小鼠24h尿液,记录尿量,用考马斯亮蓝法测定尿蛋白浓度,计算24h尿蛋白排泄量。　　1.2.3免疫荧光观察肾组织IgA的沉积用组织包埋剂将新鲜肾皮质（经课题组病理科医师确认）包埋后

7、,液氮速冻,由Leica2800型冰冻切片机(法国产)制成4μm厚的冰冻切片,贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上室温下晾干。0.1mol/LPBS缓冲液洗涤3min,洗2次,滴加异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgA抗体（上海康成公司）,室温放置1h,PBS洗涤5min,洗3次,晾干后甘油封片,在Nikon荧光显微镜下观察沉积情况,以亮绿色为阳性染色。9　　1.2.4总RNA制备取肾皮质0.1～0.2g,分别加入1mLTRIzol,按试剂说明书中操作步骤进行RNA提取。经凝胶电泳后,使用紫外分光光度仪检测提取总RNA的质量和浓度。要

8、求A260/A280≥2.0,并计算RNA含量。　　1.2.5cDNA的合成反应体系20μL,取OligodT0.5μg,每一标本取总RNA2μg,Rnasin40U,dNTP终浓度0.5mmol/L,5×反应缓冲液4μL,DTT终浓度为0.01mol/L,SupercriptTMⅡ200U,加DEPC水至20μL