YCT150-2002烟草种子转基因的测定.pdf

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1、ICS65.160x85备案号:10587-2002中华人民共和国烟草行业标准YC/T150-2002烟草种子转基因的测定Tobaccoseed-Determinationofgeneticallymodifiedorganism2002一09一12发布2002一12一01实施国家烟草专卖局发布657YC/T150-2002前言本标准由全国烟草标准化委员会农业分技术委员会提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国烟草东北农业试验站。本标准主要起草人:焦庆明、郭兆奎、闺新甫、万秀清、

2、于艳华、魏继承。YC/T150-2002烟草种子转基因的测定1范围本标准规定了烟草种子转基因的测定方法。本标准适用于烟草种子。2引用标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。YC/T149-2002烟草及烟草制品转基因的测定3术语应符合YC/T149-2002第2章的规定。4实验室要求应符合

3、YC/T149-2002第3章的要求。5试剂应符合YC/T149-2002第4章的要求。6仪器与耗材应符合YC/T149-2002第5章的要求。7样品的取样方法以品种为单位，即每个品种作为一个样品，对虽为同一品种，但种子产地或种子生产年份不同，也作为单一样品取样，每一样品随机多点取样10g，样品编号注明品种名称、种子产地和生产年份。8DNA提取8.1前处理随机取烟草种子。.5g放人装有滤纸保湿的培养皿中，28℃光照下培养5d，种子萌发出苗后，用滤纸吸出表面水分。8.2DNA提取8.2.1种子萌发后提取8

4、.2.1.1种子萌发幼苗称量约300mg，在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末，装人1.5ml，离心管中。8.2.1.2取300mg液氮研磨后的粉末，加入200pl.2XCTAB提取缓冲液，充分混匀后，65C水浴10min,82.1.3加人等体积的三氯甲烷:异戊醇(24e1)，混合均匀12000r/min离心4min.YC/T150-20028.2.1.4取上清液，加1/1。体积的10%CTAB提取缓冲液，加人等体积的三抓甲烷:异戊醇(24:1),混合均匀后12000g离心4min,8.2.1.5取上清，加等

5、体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀15000r/min离心8min,8.2.1.6去上清，沉淀加100uL高盐TE缓冲液，65℃水浴10min,8.2.1.7加人二倍体积冷无水乙醇，于一40C下30min,8.2.18isooog离心8min，沉淀溶于70IA-超纯水中。8.2.2种子未经萌发直接提取8.2.2.1将烟草种子浸泡于无菌水中过夜或放人65'C水中1h，取100mg膨涨的种子放人2mL离心管中捣碎，加人50o讨.1XCTAB抽提缓冲液，剧烈振荡混合均匀后放人65C的恒温水浴中30min。再120

6、00g离心10min.8.2-2.2取上清液，加2001,L三氯甲烷混合均匀，12000r/min离心10min,8.2-2.3取上清液，加2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温下1h,12000g离心5min,8.2.2.4去上清液，沉淀加人350川高盐TE缓冲液，加350川三抓甲烷混合30s，离心10min.8.2.2.5取上清液，加0.6倍体积异戊醇12000r/min离心10min,8.2-2.6去上清液，沉淀加人500pL乙醇轻微振荡并混合均匀，15000r/min离心10min，沉淀溶于501,

7、1超纯水中。8.3DNA含f和纯度的测定应符合YC/T149--2002第7.3条的规定。9PCR检测应符合YC/T149-2002第8章的规定。J0I烟草种子的卡那，寮抗性法测定月.压Jl1把每份种子样品分别放人1.5mL的离心管中。司0.n.J.走管内加1.0ml,70%的无水乙醇，然后立即用灭菌的移液器将无水乙醇吸出。月压﹃.J.管内加人1.0mL次氯酸钠，保持30min，期间正反混合均匀几次，然后将液体用移液器吸出。d0.刀l月用灭菌水清洗四次。月压‘..J取一个1MI，的枪头，将枪头剪开，使种

8、子能从离心管中吸出，移到1/2MS培养基上光照培养。月压亡..U将萌发的种子转移到分别含有质量分数为。pg/g,50pg/g,100pg/g卡那霉素的1/2MS培养基上生长，14d以后，以同品种的转基因阳性和阴性材料为对照，观察待测样品种子萌发及其生长情况，质量分数为100pg/g卡那霉素培养中烟苗颜色变黄，即为非转基因烟草;颜色仍为绿色，是转基因烟草材料。