《饲料中志贺氏菌活菌的检测 ema-pcr法》河南省地方标准

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1、《饲料中志贺氏菌活菌的检测EMA－PCR法》河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义志贺氏菌（Shigella）又称痢疾杆菌，属于革兰氏阴性菌，是一类具有高度传染性和严重危害性的食源性致病菌，能导致人类及仔猪、鸡、奶牛等多种动物的结肠粘膜性炎症，主要表现出恶心、呕吐、腹泻等症状，严重危害人和动物的健康。有调查显示，全球每年有1.6亿人患病，约有110万人死亡，绝大多数为5岁以下的儿童。2003年10月31日宁波市某幼儿园发生了一起集体食物中毒，共有48人发生了不同程度的高热、腹泻、腹痛、恶心、呕吐等中毒症状，发病率为36.9%，经流行病学调查、临床分析和实验室证实为由志贺氏菌引起的。志

2、贺氏菌随患者粪便排出，污染水源、环境等，或通过苍蝇、蟑螂、鼠类等间接传播。微生物污染饲料是人畜传染病传播的重要途径，饲料作为畜禽的“食物”，其质量的优劣直接影响到畜禽养殖业的经济效益及畜产品的质量安全，因此饲料的安全至关重要。目前饲料中志贺氏菌的检测一直以来是质检机构检验能力上相对较为薄弱的环节，大多仍沿用传统的细菌培养及鉴定方法，步骤繁琐，检验周期长，且容易漏检，远不能满足应对突发公共卫生事件上及时诊断、结果准确、敏感性和特异性高的要求，因此，建立一种快速、准确的检验手段非常必要。本研究以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因（InvasionplasmidantigenH,ipaH）为靶基因设

3、计一对特异性引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分志贺氏菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR检测志贺氏菌的灵敏度在1.2×102cfu/mL左右，从预增菌、样品处理、PCR扩增、凝胶电泳只需要12h左右，与传统培养方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中志贺氏菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。二、任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知

4、》（豫质监标发〔2017〕104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中志贺氏菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210484）的起草、制定工作。2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。3、编制依据主要依据以下标准：GB/T8381.2饲料中志贺氏菌的检测方法，GB19489实验室生物安全通用要求，GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：志贺氏菌活菌EMA-PCR检测方法的建立1.引物设计参考已发表

5、的文献，从GeneBank下载志贺氏菌的ipaH基因序列。根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增386bp大小的特异性引物对。表1引物序列引物序列片段大小上游5'-TTGCTGCTGATGCCACTGAGA-3'386bp下游5'-CCAGAGGGAGAACCAGTCCTTA-3'2.EMA-PCR方法参数的优化首先是探索志贺氏菌培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入EMA，制备成EMA终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。然后通过离心收集上清液，进行PCR扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳EM

6、A添加终浓度。其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、8、10min，离心收集上清液，进行PCR扩增。3.确定方法的灵敏度和特异性。4.用建立的志贺氏菌EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料样品，并与GB/T8381.2《饲料中志贺氏菌的检测方法》进行对比，以验证该方法的实用性和准确性。第二阶段：志贺氏菌EMA-PCR检测方法应用实验本阶段主要进行志贺氏菌EMA-PCR检测方法在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。共对来自全国4个省（大部分

7、样品来自河南省）共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出1批沙志贺氏菌阳性样品，并对志贺氏菌进行了分离鉴定。同时与GB/T8381.2《饲料中志贺氏菌的检测方法》进行了对比，检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法GB/T13091完全一致，但检测时间比传统培养法缩短了2-3天的时间；通过对比发现，EMA-PCR方法具有准确、快速的特点，在应用推广方面具有一定的优势。第三阶段：标准的起草、修改与制定根据以上