提取紫杉醇初分离工艺的研究

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1、紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FAD批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。　　关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃

2、取应用最为广泛，在文献报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时，选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫杉醇

3、。　　1材料方法　　1.1材料　　红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目），青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。　　DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。　　1.2方法　　1.2.1液-液萃取称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2C

4、l2的重量比为1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压蒸出回收，所得固相物溶解于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。　　1.2.2固相萃取固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样

5、品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中，抽空。依次用0.01mol/L的乙酸铵溶液10ml、50%的甲醇乙酸铵溶液淋洗，抽空。紫杉醇的洗脱：在淋洗好的柱子中加入80%的甲醇乙酸铵溶液10ml，收集洗脱液，减压蒸发。从洗脱液蒸发所得的固体物中取样，溶解于甲醇，作HPLC定性定量分析。　　1.2.3硅胶柱层析硅胶用CHCl2浸泡，超声波脱气5min，重力沉降法装柱（15mm-×260mm），用CHCl2充分洗出硅胶中的杂质至柱床透明。样品溶解于CHCl3后上柱，再用CHCl3充分洗去未被吸附的杂质，然后用3：97（v/v）

6、的CH3OH：CHCl3进一步洗脱，收集洗脱峰，HPLC测定紫杉醇的浓度和纯度。柱层析过程在常温常压下操作。　　1.2.4氧化铝柱层析CH3OH、CHCl3用分子筛脱水，层析用氧化铝190℃真空干燥6h后，用脱水CHCl3浸泡，超声波脱气5min，装成15mm×260mm的层析柱。清洗柱后上样，用CHCl3洗去未被吸附的杂质，再用1%的CH3OH、CHCl3（v/v）淋洗，最后用5%的CH3OH溶液洗脱出紫杉醇。HPLC测定其纯度，柱层析过程在常温常压下操作。　　1.2.5制备薄层层析用GF254硅胶自制100mm×200mm层析薄板，10

7、5℃活化0.5h，样品用CH3OH溶解，配成10mg/ml的溶液。毛细管点样，成线状，每板点样量在2mg左右。在对照板中点标准品和样品，用氯仿-甲醇（95：5）展开，254nm紫外光下确定紫杉醇的Rf值。切割并收集制备板上的紫杉醇带，用CH3OH洗脱下硅胶上吸附的紫杉醇，HPLC测定其纯度。　　1.2.6紫杉醇的定量定性分析采用HPLC对紫杉醇作定性定量分析：4.6mm×250mm的C18柱，检测波长为227nm，等梯度洗脱，流动相为甲醇-乙腈-水（20：32：48），流速1.0ml/min。以紫杉醇标准品为对照，外标法作定量分析。　　2结

8、果及分析　　2.1液-液萃取　　以1：1的二氯甲烷-水对粗品液-液萃取，紫杉醇富集到有机相。实验中发现，有机相与水相的分层速度慢，并有乳化现象。液-液萃取的紫杉醇回收率为94.6