过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

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1、一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：嫩豆芽5.010g2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：0.02mol/L高锰酸钾标准液配制：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，临用前用草酸钠标定。（2）Na2C2O4质量数：称取优级纯Na2C2O413.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。（3）标定数据：取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10%H2SO4溶液于锥形瓶中，加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作用）

2、。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。2KMnO4+5Na2C2O4+8H2SO4=2MnSO4+5Na2SO4+K2SO4+10CO2↑+8H2O（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据编号活酶死酶1212加入酶液体积(mL)2.52.52.52.5加入10%H2SO4体积(mL)2.52.52.52.5加入0.1ml/LH2O2体积(mL)2.52.52.52.5加入KMnO4体积(mL)0.230.241.901.94（二）结果计算1．换算系数（1mLKMnO4溶液相当于

3、多少mgH2O2）2KMnO4+5H2O2+2H2SO4=K2SO4+MnSO4+5O2↑+2H2O25211521.9*10-54.75*10-5m(H2O2)=4.75*10-5*34*1000=1.615mg2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mgH2O2/g•min）酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示酶活(mgH2O2/g·min)=式中：A—对照KMnO4滴定毫升数；B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；VT—酶液总量（ml）；V1—反应所用酶液量（ml）；FW—样品鲜重（g）；1.7—1ml0.02mol/L的KMnO4相当于1.7m

4、gH2O2酶活(mgH2O2/g·min)=0.235*50*1.7/(5.010*2.5*10)=0.159(mgH2O2/g·min)二、动力学常数的测定（一）原始数据编号12345消耗的KMnO4（mL）0.280.350.410.721.33（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0编号12345[S]0（mol/L）5.000*10-36.700*10-38.700*10-31.250*10-22.500*10-2V0（mmol/min）7.340*10-31.008*10-21.351*10-22.391*10-23.737*10-2（三）以1/V0对1/[S]0作图（

5、用excel作图）（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）求得线性关系为y=1.3921x+0.0111所以Vmax=1/0.0111=8.654*10-2KM=1.205*10-1第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。(1)每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。(2)各反应瓶的滴定终点微红色应为同一标准。(3)使用前，应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?温度，pH值和底物浓度3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧分子，在此过程中起传递电子的作用。4.在反应速度的

6、测定中，加入硫酸有哪些作用？提供反应所需的酸性条件，并作为反应物参与反应5.米氏方程中的Km有何实际应用？(1)鉴定酶：通过测定Km,可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。(2)判断酶的最适底物（天然底物）。(3)计算一定速度下底物浓度。(4)了解酶的底物在体内具有的浓度水平。(5)判断反应方向或趋势。(6)判断抑制类型。6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。因此，当底物、PH、温度和离子强度等条件相同时Km值为常数，对一酶促反应而言，在一定的条件下都有特定的K

7、m值，可用来鉴别酶。7.测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行？要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延