酶活力及其动力学常数的测定课件.ppt

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1、第九章酶活力及其动力学常数的测定酶是具有催化活性的蛋白质酶学研究是现代分子生物学不可缺少的内容。酶学研究的意义表现在①研究酶结构和功能的关系，②分析酶的改变和疾病的关系③研究酶在发育及分化中的作用，④酶标已成为现代分子生物学研究常用的工具⑤由于酶是其基因表达的产物⑥对酶工业的指导作用第一节基本概念一、酶活力指酶的催化活性。一般用国际单位表示。第五届国际生化会议推荐：在一定条件(温度和pH)下，1分钟转化lμmol底物所需的酶量为一个酶单位(1U)二、酶的比活力指每毫克蛋白中含有的酶活力单位数，用IU(U)/mg表示

2、。酶的比活力是酶浓度和酶质量的衡量标准三、酶的转换常数①分子活性：每摩尔酶分子、每分钟转换底物的摩尔数②催化中心活性：每摩尔活性亚基或催化中心每分钟转换底物的摩尔数四、KmKm是酶活性部位的一半被底物占据或酶反应达到最大反应速度一半时所需要的底物浓度，是一定温度下酶的特征常数，又称米氏常数。同一酶的不同底物有不同的Km。1/Km表示酶底亲和常数，1/Km愈大，则亲和力愈大五、V及VmV是反应速度。指单位时间内(如1分钟)每毫克酶蛋白转换底物的μmol数Vm表示在一定酶浓度和反应条件下的最大反应速度，是底物浓度足够大

3、时，酶反应速度趋向的极限值影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。※研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。第二节酶活力的测定方法一、底物浓度对反应速度的影响单底物、单产物反应酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度底物浓度远远大于酶浓度研究前提在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax目录

4、随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax目录当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax目录（一）米－曼氏方程式中间产物酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)Ｋm：米氏常数

5、(Michaelisconstant)ＶVmax[S]Km+[S]＝──（二）Km与Vmax的意义Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。②意义：a)Km是酶的特征性常数之一；b)Km可近似表示酶对底物的亲和力；c)同一酶对于不同底物有不同的Km值。Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定1.双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法Vmax[S]Km+[S]V=两边同取

6、倒数二、酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K3[E]0V[E]当[S]>>[E]时，Vmax=k3[E]酶浓度对反应速度的影响双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。三、温度对反应速度的影响最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。*低温的应用酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC温度对淀粉酶活性的影响四、pH对反应速度的

7、影响最适pH(optimumpH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性pHpH对某些酶活性的影响胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶246810二、酶活力的测定方法(一)总则①有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物②底物对酶远远过量(通常底物浓度为Km的3～l0倍)③适宜的反应温度④最适pH反应体系⑤被测的酶量适当(二)酶的测活方法1．静态法：在一定条件下将酶和底物作用一定时间后终止反应，然后直接或间接地检测底物的减少(或产物的增加)量，从而计算出酶的活力此法测活的关键步骤是反应多长时间后终止反应为解决这一问题，首先应在较高

8、酶浓度下启动反应(曲线3)，于不同的反应时间终止反应，然后作出产物浓度一时间曲线找出产物随时间线性增加的最长时间t。在正式测活中，选用低于此酶量的样品，反应到t。(或小于t。)时终止反应即可得到正确的酶活性2．半动态法于不同时间分别从反应体系中取出一定量的样品，迅速置于反应终止液中，然后通过检测并计算反应后不同时间样品中的底物减少量(或产物增加量)，从而计算