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1、常见的实验注意事项l贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？可用0.1NNaOH/0.1%SDS洗结块lNi-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？尽快用0.1NHCl冲洗lNandrop:帐号李大伟老师(lidw)密码：62732710l自己的超声波：用大10头,功率600W；用小3头,功率不大于200Wl如果pcr不成功,可能是pfu出了问题，也许是pfu没有活力（太多，太少或者buffer不对）l做酶切回收的质粒一定要用kit提l质粒连不上可能是胶回收问题，最好加异丙醇，终浓度可达50％l做SDS-PAGE的30％丙烯酰胺一定要过滤l蛋白质离心浓缩一定
2、要用水平转子l蛋白质纯化一定用milliQ的水，最好每步都加1mMDTTl所有的FPLC柱子和填料一定要用20%乙醇保存lmonoQ结合蛋白质洗脱不下来,可能都被monoQ吸附上杂质或长菌,可能是柱子上滤膜出了问题MonoQ洗柱子的方法:(实在不行重新灌柱)isopropanol10vol；1MNaCl10vol；0.5MHCl,饱和EDTA,0.5%triton,一些CTAB,10vol；1MNaCl10vol；0.0MNaCl10vol每周都要洗一次Superpose6洗柱子的方法:(实在不行重新灌柱)isopropanol10vol；1MNaCl10vol；0.5M
3、HCl,饱和EDTA,0.5%triton,一些CTAB,10vol；1MNaCl10vol；0.0MNaCl10volpH8调到用1M溶液调pH值pH6.01:4,一般是1:10pet15b加上MetMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM共21个氨基酸pet32b除去trxMHHHHHHSSGLGGENLYFQGS共21个氨基酸300ml10NNaOH非精制胰蛋白胨/L370ml10NNaOH精制胰蛋白胨Trx:14.6kDapI5.9Tev：pI8.5u可溶于碱的污染物0.1mol/LNaOH洗涤Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤结合缓冲液洗涤可以除去诸如脂类、蛋白质
4、和核酸这类的污染物。u对于疏水性污染物乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤可以除去脂类和其他的疏水性物质。u金属污染物EDTA饱和的10mmol/LHCl（即pH=2）处理柱子u沉淀物杂质去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6mol/L的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤Centrifugesamplestoavoidtheriskofnon-specificbindingofthetargetmoleculetoafilter.Samplessuchasserumcanbefilteredthroughglasswooltoremoveremainin
5、glipids.Non-specificcause:proteinsbindingtomediumand/ortotheplastictubesorthepresenceofproteinaggregatesthatco-precipitatewiththeimmunecomplexItisreportedthatCHAPSstabilizesGRandpreventsnon-specificadsorptionofGRtotubesandmono-beads[6and7.T.M.Fletcher,B.S.Warren,C.T.BaumannandG.L.Hager.Me
6、thodsMol.Biol.176(2001),p.55.FullTextviaCrossRef
7、ViewRecordinScopus
8、CitedByinScopus(1)7].载体：7.5ulNEBbuffer21ulBSA0.25ulT4dnapol0.25ul100mmdttp0.5ul100mmDtt0.5ul反应体系于22℃30min后，75℃20min将酶灭活。（另：一个文献上没有说明的优点，NEBT4DNAPOL在普通的限制性内切酶Buffer中的活性为100%，也就是说，载体酶切后不用乙醇沉淀，就可以直接用于T4处理，简化了实验流程，节省时间pfu也可以，
9、实验室协议前期工作1．进www.rcsb.org查是否已经有结构发表，特别注意unreleased部分2．进cn.expasy.org搜索目标基因，输入基因名，找出对应的种属把之下载，看看这个蛋白质的基本性质，如是否有发表的结构、功能、是否有跨膜区、所含的domain（可以进入InterPro、pfam和smart看看）、氨基酸序列、mRNA或genomicDNA序列等。3．找出蛋白所对应的mRNA序列如果基因是从别人获得，直接向别人要mRNA序列或DNA序列如果基因是从库中PCR获得，那么从ncbi(http://www.n
