波谱分析手段在蛋白质研究中的应用

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1、波谱分析手段在蛋白质研究中的应用摘要：蛋白质是人体的基本构成物质，是生物体中一类重要的生物大分子，随着研究的不断深入，生物学与化学、近代波谱技术密切结合产生了NMR、X-Ray、SPR、荧光分析以及热力学分析等多种分析手段。本文综述了波谱分析手段在蛋白质结构与功能、蛋白质相互作用以及蛋白质与配体相互作用研究中的应用及进展。关键词：波谱分析，核磁共振，SPR，X射线，蛋白质研究引言：人类的遗传物质是DNA，但是最终要通过转录，翻译生成蛋白质才能体现出来，而每种蛋白质的结构不同，进而造成具体的生物体表现不同。蛋白质具有自身特有的活动规律,随着生命活动

2、的进程表现出极其动态的紧密协调的变化,蛋白质在合成之后具有相对独立的修饰、转运和相互间作用能力,同时外界环境对蛋白质的表达起到很大的影响。因此,开展对蛋白质的研究,如蛋白质结构与功能、蛋白质相互作用以及蛋白质与配体相互作用等，才能更加贴近对生命现象和本质的掌握,生命活动的本质和活动规律才能找到答案。正是因为这样,国际科学界预言,在21世纪,生命科学的热点将从基因组学转向蛋白质组学,使后者成为新的前沿。目前，已经发展起来基于NMR、X-Ray、SPR、荧光分析以及热力学分析等多种分析手段，在蛋白质研究中发挥着巨大的作用。1核磁共振法研究蛋白质和多肽

3、的结构和功能核磁共振（NuclearMagneticResanance,NMR）是一种多功能的物理测试技术。1945年哈佛大学的Purcell和斯坦福大学的Bloch分别用实验观察到NMR现象。因此他们于1953年荣获诺贝尔物理学奖,Varian公司也生产出了第一台NMR仪,并开始用这种仪器分析鉴定小分子化合物。随着超导磁体的开发,磁场强度不断提高,分辨率和灵敏度大为改善，以及计算机技术和谱仪的飞速发展,使得快速傅里叶变换(FT)和多维NMR法相继得以实现。这些为NMR在生物、化学和医学中的广泛应用提供了条件。　　Wagner等认为,NMR法测定

4、蛋白质结构的最早里程碑是美国斯坦福大学的Jardezky等的工作,他们用NMR法测定了几十种常见氨基酸的NMR图谱。他们还和他人协作,把人工智能引进NMR测定蛋白质结构的研究中。1985年瑞士的Wuthrich等第一次用NMR法测定了一个蛋白质的溶液结构和蛋白酶抑制剂ⅡA的结构。直到1994年,一年内测定的蛋白质的溶液结构总数已超过100个。1.1NMR的特点NMR法的特点是:(1)可测定溶液中接近于生理状态的蛋白质构象；(2)可测定小分子和蛋白质作用的动力学过程；(3)可测定蛋白质可变形的尾巴部分的构象,它往往和蛋白质的活性功能紧密相关；(4)

5、NMR法是一种非损伤性测定法,对样品无破坏作用。1.2NMR法测定蛋白质结构的实验步骤6实验步骤包括:(1)样品制备：将蛋白质溶于D2O或H2O中,相对分子质量大于6000的需事先用15N或15N、13C加以标记。(2)一维NMR实验：测定1HNMR谱图,用D2O交换以及作pH、温度的影响实验等,以获取化学位移、耦合常数及有关形成氢键等信息。(3)二维NMR：测定1H-1HCOSY,DQF(DoubleQuantumFilter)-COSY,Relay-COSY,TOCSY,NOESY等,以确定耦合体系,辨别氨基酸类型,进行序列识别,并根据NOE

6、信息确定各种二级结构单元等。(4)三维NMR实验：测定CBCA(CO)NH,CBCANH,HNCO,HNHA,HCCH-COSY,NOESYTOCSY等的三维图谱，进一步确认各自旋体系，测定各种3J，作更多的序列识别和二级结构单元确定。(5)四维NMR实验：测定13C/15N编辑的NOESY或13C/13C编辑的NOESY谱，对重叠严重的一些谱峰的NOE相关性进行分析。1.3NMR测定法的结构计算关于NMR测定法的结构计算可以概括为如下图所示的程序：输入NOE,β折叠,氢键和二面角等数据—→动力学模拟淬火—→分子动力学优化—→初始结构—→叠代计算

7、—→能量最小化—→最佳构象组1.4核磁共振技术应用进展近年来，核磁共振技术不论在谱仪性能还是在实验方法上都有了巨大的进步，一方面随着600兆周超高场核磁共振谱仪的应用，NMR技术的灵敏度和分辨力有了很大的提高，另一方面随着选择和多重选择的激励技术，接力和反向等见解检测技术和梯度场技术等的出现，采用多脉冲，进行多重磁化转移，检测多种量子相干的二维，三维乃至多维NMR实验方法如雨后春笋般地出现。特别是近年来随着生物工程技术的发展15N和13C同位素标记的蛋白质制备成为可能，利用15N和13C等核种的杂核三维和四维等新颖的NMR技术得以克服信号重迭，简

8、并和运动相关时间长引起的信号变宽等障碍，把可归属的蛋白质分子量范围一举扩展到30KDa左右，这些技术与分子力学计算、分子力学模拟和三维图