实验八：微生物大小及数量测定

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1、实验八：微生物大小及数量测定一、实验目的1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法；2、掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识；3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。二、实验原理1、微生物大小的测定微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，

2、而是用于校正目镜测微尺每格地相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。2、显微直接计数法5将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微

3、镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又

4、分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则：1mL菌液中的总菌数=×25×104×B=5×104×A·B（25个中格）=×16×104×B=3.2×104×A·B（16个中格）三、溶液试剂1、菌种

5、：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌；2、溶液试剂：0.1%吕氏碱性美蓝染液，蒸馏水；3、仪器及其他用品：目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、血细胞计数板、移液器、锥形瓶、双层瓶（含二甲苯、香柏油）等。四、实验内容1、微生物大小的测定（1）目镜测微尺的安装把一侧5目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。（2）校正目镜测微尺将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某

6、一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。由于已知镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（μm）=（3）菌体大小的测定①　制作枯草芽孢杆菌的单染色制片洗片→干燥→加热、固定、干燥→美蓝染色1min30s→自然干燥②　制作酵母水浸片玻片中央滴一滴美蓝→接种酵母菌→盖盖玻片③　将镜台测微尺取下，换上细菌制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大

7、小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，然后计算取平均值。本次实验取三个。2、显微镜计数（1）血球计数板清洗。（2）自然干燥。（3）对酵母菌液进行适当的梯度稀释。取原液1mL到试管中，用移液管移取9mL水注入试管中。再取上一次稀释的菌液中的1mL加到另一支试管中，加9mL水。依此类推。即可得到一系列稀释梯度的菌液。（4）加样品。血球计数板盖上盖玻片，将