贵州野生天麻遗传多样性的aflp指纹分析论文

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1、贵州野生天麻遗传多样性的AFLP指纹分析论文程纪伦,范爱辉,苟占平,典灵辉,杨丽,王晓丽【摘要】目的研究野生天麻的遗传多样性，为合理利用野生天麻种质资源、为天麻的进一步系统选育研究提供一定的理论依据。方法利用AFLP技术，采用8对M+3和P+3引物组合对23份贵州野生天麻品种进行了总基因组DNA水平上的多态性检测，用NTSYSpc-2.10s软件的UPGMA方法对检测结果进行聚类。结果共获得552条可统计的条带，其中396条呈多态性，多态性带百分率约72%。UPGMA聚类可以将贵州不同产地的野生天麻很好地区分开来。结论该实验揭示了贵州

2、野生天麻种质丰富的遗传多样性，聚类分析结果表明多数来源地相同的天麻种质表现出较为密切的亲缘关系。【关键词】野生天麻；遗传多样性；AFLPAbstract：ObjectiveTostudythegeicpolymorphismofplasmresourcesandcultivatingneong23erbinations(M+3andP+3).Thedeterminedmolecularmarkersethodofsoftorphic,andthehighratioofpolymorphicbands(86%)fromthecluste

3、ringofUPGMAshoarkersoforphism；AFLP天麻为兰科(Orehidaeae)多年生草本植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥根茎.freelol·μl-1)1μl；PstⅠ或EcoRⅠ接头（5pmol·μl-1）1μl；10mMATP1μl；5μl浓度为100～200ng·μl-1天麻基因组DNA；T4DNAlingase（5U·μl-1）0.4μl；MseⅠ（10U·μl-1）0.5μl；PstⅠ或EcoRⅠ(10U·μl-1)0.5μl。37℃保温过夜后取5μl酶切－连接产物于1.0%琼脂糖凝胶

4、上电泳检测。2.2.2预扩增预扩增PCR反应体系（20μl）为：ddH2O10μl；10×buffer2μl；dNTP(2mM)2μl；Mg2+(20mM)1.5μl；Taq酶(2U·μl-1)0.5μl；酶切－连接产物2μl；引物M00(50ng·μl-1)1μl；引物P00或E00(50ng·μl-1)1μl。预扩增PCR反应程序为：95.0℃5min－95.0℃35s－56.0℃35s－72.0℃1min－GOTOSTEP230cycles－72.0℃5min－4.0℃保温。反应结束后取5μl预扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳

5、检测。剩余的预扩增产物用TE(pH8.0)溶液稀释20倍后于-20℃保存，以待选择性扩增用。2.2.3选择性扩增选择性扩增PCR反应体系（20μl）为：ddH2O7μl；10×buffer2μl；dNTP(2mM)2μl；Mg2+(20mM)1.5μl；Taq酶(2U·μl-1)0.5μl；稀释20倍的预扩增产物5μl；M引物(50ng·μl-1)1μl；P或E引物(50ng·μl-1)1μl。选择性扩增PCR反应程序为：95.0℃5min－95.0℃40s－65.0℃（每循环降低0.7℃）40s－72.0℃1min－GOTOSTEP

6、213cycles－95.0℃40s－56.0℃40s－72.0℃1min－GOTOSTEP624cycles－72.0℃5min－4.0℃保温。选择性扩增产物与7μl的LoadingBuffer混和，95℃变性5min，立即转移至冰浴冷却，待用。2.2.4选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳时，先安装好垂直电泳槽然后灌入1×TBE电泳液，排除点样孔气泡，2500V恒压预电泳40min。预电泳后将7μl变性后的选扩产物上样于点样孔内，2500V恒压电泳至第一条指示剂条带跑至胶板底边时停止，电泳时间约2～3h。然后银

7、染显带［3］。2.3数据统计与分析AFLP电泳图谱用GelProAnalyzerVersion410分析,只记录那些可辨认的、两次扩增结果一致的条带，同一位点有带记为“1”,无带记为“0”，形成0/1矩阵图输入计算机，采用NTSYSpc-2.10s软件的UPGMA方法对检测结果进行聚类，计算出天麻各样品的遗传相似度。3结果3.1天麻基因组DNA图谱结果见图1。3.2AFLP结果分析利用从30对引物中筛选出的8对AFLP引物对23份野生天麻种质的基因组DNA进行片段长度多态性扩增，获得了较好的扩增结果（见表2）。共扩增出552条谱带（1

8、00～700bp），其中396条具有多态性，占72%，平均每对引物扩增出69条可统计的带，其中50条具有多态性。可见，AFLP检测野生天麻种质资源遗传多样性的效率很高，也充分体现了野生天麻的遗传多样性。结果见图2。表28