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1、试论盐芥miRNA393沉默载体的构建的论文摘要将与内源mrna编码区同源的小片段外源双链rna导入细胞中,通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mrna降解,可导致特定基因表达沉默。通过pcr扩出与mirna399互补的ips,并改造成与mirna393互补的ips′,测序正确后酶切连入3301h载体转化盐芥。 关键词盐芥;mirna393;沉默载体;构建 中图分类号q752文献标识码a文章编号1007-5739(2010)23-0011-01 constructionofmirna393silencedvectorint
2、hellungiellasalsuginea chenlong-junhouleijihong-fei (collegeoflifescience,shandongnormaluniversity,jinanshandong250014) abstractallexogenousdsrnastocellsthatarehomologictotheirendogenesisrna′sproteincodingregion,theycanleadspecificgenetosilencebyseriesofreactionsrn
3、atodegrade.thegeneipsentarytomirna399sequenceentarytomirna393.aftermakingsurethesequceright,theyconnectedtheaidgeneptyvector. keyirna393;silentvector;construction 作为一种小rna,mirna很难得到它的缺失突变体。.因为每个mirna家族中有多个成员,各成员核苷酸序列相似,仅把其中一个沉默,并不影响靶基因的剪切,不会出现预期表型。为mirna研究带来一定困难。2
4、007年,jose′manuelfranco-zorrillal等在研究低磷诱导的mir399时,发现了一个非编码的ips1,ips1具有短的不保守的开放读码框,有编码四肽(met-ala-ile-pro)的潜能[1-2]。并且具有一个23bp的基序,该基序是保守的,并且其能够与mir399互补配对。然而这种互补配对并不完美,而是存在一个关键错配,在mirna的10~11座位形成1个突起的环。而这个区域的序列互补恰恰对于mirna指导的mrna的剪切十分重要[3-4],为获得mirna沉默突变体带来了方便。目标模拟[5-6]为人们
5、提供了一种新的策略来抑制特异mirna的活性。 1材料与方法 1.1试验材料 供试材料:盐芥(t.halophila)。供试菌株:大肠杆菌(e.coli)菌株为dh5α;农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)菌株为gv1301菌株。载体:pmd18-t,3301h。 1.2试验方法 1.2.1制备目的基因。用ips1-5′/ips1-3′从盐芥中扩出ips序列。用ips1-5′-2/ips1-3′以ips为模板pcr扩增出ips3′端。用改造的ips-393-3′/ips1-5′以ips为模板pcr出
6、ips5′端。3′端/5′端用hindiii酶切连接。以改造的ips393为模板用ips1-5′/ips1-3′为引物进行扩增。 1.2.2连接转化。将pcr产物电泳分离,用geneclean法回收。回收产物与t载体连接。挑dh5a单菌落于lb液体培养基中,37℃振荡培养12h;取500μl加入50mllb中,培养至od600=0.5;菌液冰浴30min;4℃、5000r/min离心10min;弃上清,加入8ml预冷的无菌0.1mol/lcacl2溶液重悬;4℃、5000r/min离心5min,弃上清;用1ml预冷的0.1mol
7、/lcacl2重悬,200μl/份分装,加入适量连接产物混匀,冰浴30min;42℃处理90s,冰浴2min;加入1ml的lb,于37℃振荡1h;涂板37℃过夜培养。 1.2.3提质粒。挑单菌落于3mllb中,37℃过夜。收集菌体5000r/min离心1min,重复1次。弃上清,加入200μlsolutionⅰ重悬;加入300μlsolutionⅱ,混匀;加入300μlsolutionⅲ,混匀;加等体积氯仿混匀,于11000r/min离心10min,取上清加等体积异丙醇,-20℃沉淀30min;13000r/min离心15min
8、;去上清,加入500μl70%乙醇洗涤;13000r/min离心3min,弃上清;60℃烘干溶解加2μlrnase,37℃消化。在10μl反应体系中加入1μl质粒、1μl6×loadingbuffer、7.7μl无菌水0.3μl的pst、1%琼脂糖
