核酸分子杂交技术

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1、核酸分子杂交技术分子生物学实验室张华屏简要概述琼脂糖凝胶电泳凝胶的制备以琼脂糖为溶质，电泳缓冲液为溶剂，用微波炉加热，配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却。样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使样品集中。电泳低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，所用电压不宜高于5V/cm。cm：电场正负极间的距离。染色和拍照常用荧光染料溴化乙锭（EB）染色，

2、在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。将已知分子量的标准DNA的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知DNA片段在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。核酸分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸,杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核

3、酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间。核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一,是定性或定量检测特异DNA或RNA序列片段的有力工具．在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的探针进行菌落杂交，可以从cDNA文库或基因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体；用克隆化的DNA片段做探针杂交，可以确定基因组DNA上特定区域的核苷酸同源序列或对某一已知基因进行染色体定位．另外，用于遗传疾病的基因诊断，限制性片段长度多态性疾病的相关分析，基因连锁分析，法医学上的

4、性别分析和亲子鉴定等．主要内容分子印迹（渍）技术固相支持物（硝酸纤维素虑膜和尼龙膜）的特点分子印迹（渍）的分类分子杂交技术核酸分子杂交的原理探针（probe)探针的分类探针的制备Southern杂交技术重点内容分子印迹（渍）的分类DNA的变性和复性放射性标记探针的制备方法Southern杂交的基本步骤分子印迹（渍）技术将待测生物大分子结合到一定的固相支持物上的方法。(这些结合在固相支持物上的生物分子即可与存在于液相中的探针分子进行杂交。)固相支持物与有效的转移方法是此技术的成败关键。固相支持物应具备的特点：1.具有较强的结合核酸分子的能力（>10µg/cm2）2.与核酸结

5、合后，不影响其与探针分子的杂交反应。3.与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作。4.非特异性吸附少，洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉。5.具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。几种常用固相支持物硝酸纤维素滤膜（nitrocellulosefiltermembrane）具有较强吸附单链DNA和RNA的能力（高盐下达80µg/cm2～100µg/cm2）。真空烘干后，依靠疏水性相互作用。杂交本底较低不易反复杂交和洗膜（结合力）质地较脆，烘烤后更甚，需小心操作与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，不易核酸电转尼龙膜（nylonmembrane）结合单链DNA和

6、RNA的能力比NC膜强（达350µg/cm2～500µg/cm2）。真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。韧性较强，操作方便。能结合小分子核酸。低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。可反复杂交和洗膜。杂交本底较高是指将核酸，蛋白质等生物大分子固定在纤维膜上的过程。(将核酸或蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上)转膜转膜的方法（1）物理吸印方法（毛细虹吸或真空抽吸）（2）电转印方法印迹（渍）技术SouthernBlotNor

7、thernBlotWesternBlotEasternBlotDotBlotInsituhybridizationSouthernBlot－－DNA（由EdwinMellorSouthern等人首次应用）1975年，Southren创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜（NC膜）上，再进行杂交的方法，被称为Southren印迹法。NorthernBlot－－RNAAlwine等将类似方法用于RNA印迹，被称为Northern印迹。WesternBlot－－Protein（immunoblotting)1979年Towbin