单元3 菌种保藏与复壮

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1、单元3菌种保藏与复壮模块1菌种的保藏在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。菌种保藏的意义菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。菌种保藏的原理Ø菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一

2、般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。Ø一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。Ø一、理想的菌种保藏方法应具备的条件Ø(1) 经长期保藏后菌种存活健在；Ø(2)  保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。Ø(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。Ø一、微生物菌种保藏要求在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本方法：由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适

3、应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。世界上最早建立的菌种保藏室·捷克微生物学家FrantisekKral布拉格大学副教授，讲授细菌学和真菌学课程。1890年，Kral建立了私人细菌学实验室，即KRAL细菌学实验室，同年建立了世界上第一个微生物菌种保藏室，保藏有800多个微生物菌种，相继公布了5个版本的菌种目录。1911年，去世，二战被毁，原保藏的菌种几经转移，至今已寥寥无几。最早建立且延

4、伸至今的是1906年建立在荷兰的微生物菌种保藏中心(cbs国际重要菌种保藏机构名称美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市国立标准菌种保藏所，英国，伦敦中国菌种保藏单位二、工业微生物菌种保藏技术(1)超低温或在液氮中冷冻保藏；(2)冷冻干燥或真空干燥保藏；(3) 转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。菌种保藏方法暂时保藏法蒸馏水悬浮保藏斜面传代法穿刺法长期保藏法液体石蜡法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法麸皮保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法蒸馏水悬浮保藏·最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌

5、蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌及酵母菌等可用于此法。·2.1冷冻保藏·冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。·通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。·冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。·冷冻保藏种类·一、普通冷冻保藏技术(-20℃)·二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)·三、液氮冷冻保藏技术·普通冷冻保藏技术(-20℃)·将液体培养物或从琼脂斜面培养物

6、收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。·用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。·应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。·保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。·这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。·超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)·要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。·在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是

7、：·1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；·2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；·3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；·4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。·如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。·三、液氮冷冻保藏技术·(一)冷冻保护剂·在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜

8、最好为过滤灭菌。·(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤·1．待冷冻保