萨福克羔羊卵泡诱导的影响因素分析

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1、萨福克羔羊卵泡诱导的影响因素分析　　体外胚胎生产技术的效率，与卵母细胞和质量密切相关[1-3],屠宰场采集的卵母细胞由于品种、健康状况等因素都不明确，无法用于体外胚胎生产。而成年羊的活体采卵技术，因对供体羊伤害大，效率低，也无法用于生产实践，但利用羔羊作为供体，可以避免以上的不足。因幼龄动物体外胚胎生产及移植技术（Juvenileinvitroembryotransfer,JIVET）能提供高于成年羊数以10倍的卵母细胞，极大地缩短了时代间隔，因而可应用于转基因、核移植等生物技术和动物新品种的培育[4].目前，已有诱导牛[5-6]、

2、山羊[7-8]和绵羊[9-13]等品种幼龄阶段卵泡发育的研究，而在绵羊的研究中，以Kelly等[10-12]的研究最为详细，其研究了EGF、IGF-1等生长因子对羔羊卵母细胞体外发育的影响，在对美利奴羔羊的研究中，1只4~8周龄的羔羊最多获得了13.9只后代的效果。　　Gou等[13]研究了季节对细毛羊羔羊诱导效果的影响，发现秋季效果好于春季和冬季。　　虽然细毛羊羔羊卵泡发育效果较好，但对萨福克羔羊的研究较少，而萨福克属于肉用绵羊，其激素诱导方案是否与细毛羊一致，还没有定论。本研究以此为切入点，研究可能影响萨福克羔羊卵泡诱导的因素，

3、以期获得稳定的萨福克羔羊选择标准，以及季节对卵泡发育和卵母细胞发育的影响，旨在为萨福克羔羊体外胚胎规模化生产奠定基础。　　1材料与方法　　1.1羔羊的选择及试验设计本试验在阿克苏地区天山肉用种羊有限责任公司养殖基地进行。试验1:根据羔羊体况和精神状态，随机选择45只萨福克羔羊，根据出生日龄，将试验组设为5~6和8~9周龄组。试验2:将试验1中所用的5~6周龄共39只萨福克羔羊，根据体重将其分为8~10、11~12和13~18kg3组；试验3:随机选择采食、精神状态等正常，无病状表现的出生年龄、体重等较为接近的53只萨福克羔羊用作供体

4、，将其中部分羊曾因病注射过抗生素的设为亚健康组，其余羔羊无疾病史，设为健康组。试验4:在春、秋季，随机选择5~9周龄、初生重相近、精神状态良好的萨福克羔羊83只进行激素诱导，将2个季节的羔羊卵泡发育效果进行统计，以分析季节对激素诱导效果和卵母细胞质量是否存在差异。试验5:分别将试验4中春、秋季获得的羔羊早期胚胎进行移植，以研究季节对羔羊胚胎移植效果是否有影响。　　1.2羔羊的处理本试验使用的垂体促卵泡素（FSH）为加拿大BIONICHE公司生产的FOLLTROPIN-V,孕马血清（PMSG）为宁波三生激素有限公司生产。按照试验设计，

5、随机选择羔羊，每只羔羊使用FSH剂量为160IU以等剂量的方式每日早晚间隔12h各注射1次，共注射4次，在第1次注射FSH的同时，注射500IUPMSG,禁食禁饮，羔羊手术采卵前称量羔羊体重。　　1.3受体羊的选择及处理选择健康、无明显繁殖疾病的经产本地母羊用作受体。受体羊进行同期发情处理：埋植海绵栓12d,在打第4针时撤栓，同时注射333IU/只的PMSG,撤栓后36~48h各试情1次，发情的羊用作受体。　　1.4卵母细胞的回收及评定将饥饿12h的羔羊保定在手术架上，腹部刮毛，用清水擦洗后，碘酒棉球转圈消毒，用75%酒精脱碘，在腹

6、中线左侧或右侧，避开血管，手术切开两指长的小口，将单侧卵巢暴露于体外，用经盐水湿润的灭菌纱布将卵巢包裹，用吸有抽卵液的带8号针头的10mL注射器，从卵巢底部开始逐渐向上抽吸卵巢表面的卵泡，将回收的卵泡液入至60mm培养皿，在体视显微镜下捡出所有卵母细胞，集中在不含肝素钠的抽卵液洗盘内，选择可用卵母细胞用作体外培养。　　抽卵液为：TCM199-Hepes（Sigma）+2%FBS（Sigma）+0.027mg/mL肝素钠（Sigma）。　　根据卵母细胞-卵丘细胞复合体中卵丘细胞的多少、包裹的紧密程度及卵母细胞胞质均匀度来选择卵母细胞。

7、将包裹3层以上颗粒细胞、胞质均匀的卵母细胞定为可用卵母细胞。　　1.5卵母细胞体外成熟培养提前2h,在CO2含量体积分数为5%、温度为38.6℃的二氧化碳培养箱内平衡成熟培养液。将可用卵母细胞用不含肝素钠的抽卵液洗涤2遍，成熟培养液洗涤3遍后，按40~60枚/孔的密度放入平衡好的四孔板内培养。　　体外成熟培养液为：TCM199-HCO3+10%FBS（GIBCO）+0.05IU/mLFSH+0.05IU/mLLH+1μg/mLestradiol+24.2μg/mL丙酮酸钠+60μg/mL谷氨酰胺+0.1mmol/L

8、半胱氨酸+10ng/mLEGF+0.1mg/mL双抗（北京鼎国）。　　　　1.6卵母细胞体外受精将体外成熟培养22~24h的羔羊卵母细胞取出，在0.1%透明质酸酶内反复吹吸，脱去部分卵丘细胞，放入平衡好的装有体外受精液的四孔板内。