hplc加样回收率试验怎么做

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现在一般都用第二种方法，又分两种添加方法：1添加样品中含量一半的80%、100%和120%，每个两份2添加样品中含量一半的50%、100%和150%，每个两份。这两种都可以的计算时添加后测得的含量与原来样品的含量一半之差作分子，添加的含量做分母，并计算这6个结果的RSD，小于3%即可。  现在一般都用第二种方法，又分两种添加方法：1添加样品中含量一半的80%、100%和120%，每个两份2添加样品中含量一半的50%、100%和150%，每个两份。这两种都可以的计算时添加后测得的含量与原来样品的含量一半之差作分子，添加的含量做分母，并计算这6个结果的RSD，小于3%即可。  验证内容有：准确度、精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。视具体方法拟订验证的内容。附表中列出的分析项目和相应的验证内容可供参考。方法验证内容如下一、准确度正确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率(%)表示。准确度应在规定的范围内建立。1．含量测定方法的准确度原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。如该法已建立了精密度、线性和专属性，准确度有时也能推算出来，不必再做。2．杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。假如不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。如不能测得杂质或降解产物的相对响应因子，则可用原料药的响应因子。应明确证实单个杂质和杂质总量相当於主成分的重量比(%)，或是面积比(%)。3．数据要求在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，例如制备3个不同浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率(%)，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。所以加样回收率反映的是方法的准确度，是评价方法好坏的指标这一，是误差理论在药物质量标准中的具体应用。准确度=(测量值-真实值)/真实值*100%。实际工作中，其实不存在药物的真实值的(我们所有的数据都是测量值，都是人们用一定的方法测出来的)。其他领域也一样。於是人们找一种比较可靠的得到的值规定为真实值。这就是加样回收率的方法。比如，为了评价阿司匹林片剂的含量测定方法，用天平称一定量(如：100mg)的对照品，加入到阿司匹林的片剂辅料中，这一定量的对照品就是真实值。用建立的方法测出来是99mg，这个方法的准确度就是99%，或加样回收率是99%，根据药品的具体情况，当这个回收率达到一定范围时(比如99%-101%)就认为方法是准确的。关于加样回收率的讨论已有报道［１－３］，虽对加样回收率的两种计算方法均从不同侧面做了较透彻的讨论与选择，但均忽略了原样品（实际样品）中待测组分含量确定的方法及其误差性质对回收率结果可靠性的影响，有必要做进一步的探讨作为补充。设原样品中待测组分的真实量为Ｘｏ，待测组分纯品标准加入的真实量为Ｙｏ，为统一讨论，我们把Ｙｏ的获得及加入过程也看为一种测量，那么，Ｘｏ、Ｙｏ及其总量的测得量分别为Ｘ、Ｙ和Ｚ，它们的测量误差分别为ＥＸ、ＥＹ和ＥＺ，则目前回收率Ｒ有如下两种计算方法依据测得Ｘｏ的方法不同分以下两种情况讨论。 １成熟方法包括药典法及可靠的文献法。由于选用的方法成熟可靠，测量误差小，则ＥＸ可忽略，而且Ｙｏ的获得及加入过程一般是可靠的，Ｅｙ亦可忽略，则（１）、（２）式可分别简化为（３）、（４）式：两式中，Ｒ唯一地与测量误差ＥＺ相关，理论上讲，可以用来检验拟订方法的准确度。２拟订方法同上讨论，Ｅｙ可以忽略，但由于Ｘ０是按拟订方法测得的，故ＥＸ不可盲目忽略，则（１）、（２）式可分别简化为（５）、（６）式：Ｒ并不唯一地与ＥＺ相关，还与测定原样品中Ｘｏ的误差ＥＸ有关，是否可以用来检验拟订方法的准确度需要做进一步的讨论。测量误差按其性质分为两类：偶然误差和系统误差，系统误差又包括恒定误差和比例误差。偶然误差可以通过增加试验次数来消除，本文不做更深讨论，而系统误差却会给测定带来固定方向的偏差。２．１系统误差为恒定误差：此时ＥＸ＝ＥＺ，所以（５）、（６）式可写为（７）、（８）式：即在该情况下，无论拟订方法的误差多大，回收率均为１００％。结果显然是不可靠的。２．２系统误差为比例误差：设比例误差的比例系数为Ｅ，则ＥＸ＝Ｅ·Ｘｏ，ＥＺ＝Ｅ·（Ｘｏ＋Ｙｏ），则（５）、（６）式可分别写成（９）、（１０）式：回收率的实质是单位真实量的测得量，而Ｅ是单位真实量的测量误差，所以Ｒ应等于１＋Ｅ，此时，用（９）式计算回收率是可靠的，而用（１０）式计算，Ｒ随Ｘｏ／（Ｘｏ＋Ｙｏ）的值变化而变化，当且仅当Ｘｏ／（Ｘｏ＋Ｙ ｏ）＝０，即Ｘｏ＝０或Ｙｏ为无穷大时，Ｒ＝１＋Ｅ。但前者回收率试验实质上已是模拟样品回收率，而后者已变为纯品回收率试验，均不在本文讨论范围之内。上面讨论的是两种极端情况，而在实际工作中，测量误差既包括恒定误差，又包括比例误差，文献认为：“仪器由于灵敏度等原因，测量一般为恒定误差，而方法误差也不全为比例误差，”另外，由于操作者造成的误差也往往表现为恒定误差，如对滴定终点指示剂变色的判断等。这说明目前定量研究的误差多属恒定误差，所以用拟订方法测定原样品中待测组分的含量后计算回收率的方法并不可靠。因此，虽然目前绝大多数药物分析工作者在做加样回收率计算时均使用（１）式，认为测得总量减去原样品测得量后即可消除原样品中待测组分含量及其测量误差的影响，但却未考虑到并非所有情况下均适用，反而会因此获得一个不真实的回收率，错误判断拟订方法的准确度。例：我们把某一测定方法假设为一根容量足够大的刻度吸量管，首先我们假设它有恒定误差，它的Ｏｍｌ刻度处实为１０ｍｌ，其余部分准确，即本吸量管有一１０ｍｌ的恒定误差，下面结合上述讨论对该吸量管（即某一测定方法）的准确度做一个检验。设Ｘ０＝２０ｍｌ，Ｙ０＝１０ｍｌ，则ＥＺ＝－１０ｍｌ。如用（３）、（４）式计算：（３）Ｒ＝１＋（－１０）／１０＝０％（４）Ｒ＝１＋（－１０）／（２０＋１０）＝６７％如用（５）、（６）两式计算：（５）Ｒ＝［１０＋（－１０）－（－１０）］／１０＝１００％（６）Ｒ＝（２０＋１０）＋（－１０）／２０＋１０＋１０＝１００％由上可见，对于一个设定的明显有很大误差的测定方法，用拟订方法测定Ｘ０后计算却得出了“理想”的回收率 数据，可见如此计算在测定存在恒定误差的情况下是不可靠的；而用成熟方法测定Ｘ０后，均得出方法不准确的结论，但用两式计算，结果明显不同，我们认为造成这一现象的原因是对于每次测定来说，由于误差恒定，（３）式把本应该由整个测定样品负担的误差均加在了测定样品的一部分，即Ｙ０上，导致相对误差增大，也因此用（４）式计算比前者相对误差小，更接近１００％（无论ＥＺ的正与负）；同时，我们还可发现当Ｙ０变化时，Ｒ也在不断变化，那么，虽然从数学的角度来看，（４）式的计算是合理的，但到底加入量ｙ０为多少时及选择哪种计算方法回收率计算的结果是可靠的呢？关于加样回收率试验中Ｙ０为多少合适尚无统一说法，相对于原样品取量中待测组分的含量，Ｙ０为其几分之一至数倍的都有，从设计方法上考虑，有的是数份回收率试验中均加入统一量的Ｙ０，有的是Ｙ０各不相同并形成一个梯度差，也有的Ｙ０相同而原样品的取量不同等等，并且的确由于加样量不同得到了不同的回收率结果。我们认为在某个拟订方法的操作中，原样品的质量及其取样量是相对恒定的，那么该方法应存在一个“实际回收率”，即实际工作中，对样品中的Ｘ。用拟订方法测得Ｘ后，Ｘ／Ｘ０的值，做为上例中的样品，Ｘ０＝２０ｍｌ，ＥＺ＝１０ｍｌ，那么“实际回收率”就应为［２０＋（－１０）］／２０＝５０％，这是最具有实际意义的数据，所以，无论加样量为多少或何种计算方法，回收率能够达到这一数据的即是正确的加样量及正确的计算方法，由此计算出的数据就是可靠的数据。对于（４）式，Ｙｏ无论多大，Ｒ总是以５ ０％为起点（即以１＋ＥＺ／Ｘｏ为起点），随Ｙ０的增大，Ｒ无限接近１００％，显然不能选择这种计算方法，更无从谈及加样量的问题；而用（３）式计算，Ｒ以负无穷大为起点（即以１＋ＥＺ／Ｙｏ为起点），随Ｙｏ的增大，Ｒ无限接近１００％，当Ｙｏ＝Ｘｏ时，Ｒ＝５０％，恰好与“实际回收率”相等。所以，当测量误差为恒定误差时，应选用（３）式计算，Ｙｏ应同原样品中待测组分的含量相等或接近。如果Ｙｏ小于原样品的含量，会夸大其误差，可能导致拟订方法失败的结论，而如果随意加大Ｙｏ，也可能会掩盖拟订方法的误差，给将来的进一步工作埋下隐患，两种情况下均会得到不可靠的回收率数据，应尽量避免。关于该吸量管为比例误差的情况可如上设定讨论，此不赘述。此时用（４）式或（９）式计算，结果是相同的，而对于纯品加入量Ｙ０要求不很严格，只是不宜大小。结果。我们认为在某个拟订方法的操作中，原样品的质量及其取样量是相对恒定的，那么该方法应存在一个“实际回收率”，即实际工作中，对样品中的Ｘ。用拟订方法测得Ｘ后，Ｘ／Ｘ０的值，做为上例中的样品，Ｘ０＝２０ｍｌ，ＥＺ＝１０ｍｌ，那么“实际回收率”就应为［２０＋（－１０）］／２０＝５０％，这是最具有实际意义的数据，所以，无论加样量为多少或何种计算方法，回收率能够达到这一数据的即是正确的加样量及正确的计算方法，由此计算出的数据就是可靠的数据。对于（４）式，Ｙｏ无论多大，Ｒ总是以５０％为起点（即以１＋ＥＺ／Ｘｏ为起点），随Ｙ０的增大，Ｒ无限接近１００％，显然不能选择这种计算方法，更无从谈及加样量的问题；而用（３）式计算，Ｒ以负无穷大为起点（即以１＋ＥＺ／Ｙ ｏ为起点），随Ｙｏ的增大，Ｒ无限接近１００％，当Ｙｏ＝Ｘｏ时，Ｒ＝５０％，恰好与“实际回收率”相等。所以，当测量误差为恒定误差时，应选用（３）式计算，Ｙｏ应同原样品中待测组分的含量相等或接近。如果Ｙｏ小于原样品的含量，会夸大其误差，可能导致拟订方法失败的结论，而如果随意加大Ｙｏ，也可能会掩盖拟订方法的误差，给将来的进一步工作埋下隐患，两种情况下均会得到不可靠的回收率数据，应尽量避免。关于该吸量管为比例误差的情况可如上设定讨论，此不赘述。此时用（４）式或（９）式计算，结果是相同的，而对于纯品加入量Ｙ０要求不很严格，只是不宜大小。关于药物定量分析中加样回收率实验的再探讨 回收率包括绝对回收率和相对回收率。绝对回收率考察的是经过样品处理后能用于分析的药物的比例。因为不论是生物基质还是制剂辅料中的药物，经过样品处理都有一定的损失。做为一个分析方法，绝对回收率一般要求大于50%才行。它是在空白基质中定量加入药物，经处理后与标准品的比值。标准品为流动相直接稀释而来，而不是同样品一样处理。若一样，只是不加基质来处理，可能会有很多影响因素被此屏蔽掉。如全部转移有机相时只转移了98%等。也就因此失去了绝对回收率的考察初衷。 　　相对回收率严格来说有两种。一种是回收试验法，一种是加样回收试验法。前者是在空白基质中加入药品，标准曲线也是同此，这种测定用得较多，但有标准曲线重复测定的嫌疑。第二种是在已知浓度样品中加入药物，来和标准曲线比，标准曲线也是在基质中加药物。相对回收率主要考察准确度。准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。有时也称真实度。一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含量测定、杂质定量试验等。准确度应在规定的范围内建立，对于制剂一般以回收率试验来进行验证。试验设计需考虑在规定范围内，制备3个不同浓度的试样，各测定3次，即测定9次，报告已知加入量的回收率（％）或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。　　1.含量测定原料药可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，必要时，与另一个已建立准确度的方法比较结果。一般制剂的含量测定的回收率是向辅料中加入处方量80％、100%、120%已知含量的主药，按含量测定的方法测定。溶出度测定方法的回收率按处方量50％、80％、100％加入主药进行测定。　　2.杂质定量试验杂质的定量试验可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典方法或经过验证的方法。 如不能测得杂质的相对响应因子，可在线测定杂质的相关数据，如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱，当杂质的光谱与主成分的光谱相似，则可采用原料药的响应因子近似计算杂质含量（自身对照法）。并应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（％）或面积比（％）。