登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达.doc

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1、登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达【摘要】　　目的：构建登革2型病毒NGC株E基因区1~476bp的原核表达载体并进行原核表达。方法：将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+)，命名为pET28a(+)-En；经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21（DE3）菌株，用IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白；对表达蛋白进行纯化，并滴定对C6/36细胞的TCID50。结果：（1）成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明，E基

2、因区部分序列获得高效表达，相对分子量约为23kD,表达量约占菌体总蛋白的29%；Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合；（2）用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白，纯度达90%；（3）DEN-2NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1ml。结论：pET28a(+)-En可在BL21（DE3）菌株中高效表达，DEN-2NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用。【关键词】登革热病毒；基因，E；基因顺序；基因表达　　［Abstract］

3、Objective:ToconstructexpressionvectorofgeneEpartialsequenceofdenguevirustype2strainNGCforprokaryoticexpression.Methods：GeneEpartialsequenceofdenguevirustype2strainNGCwasamplifiedbyRT-PCR,insertedintoprokaryoticvectorpET28a(+),andtransformedE.coliBL21cells.Thegenepart

4、ialsequencewasexpressedundertheinductionofIPTG.TheexpressedproductswasidentifiedbySDS-PAGEandWestern-Blotandpurified.Thecytotoxicity(indicatedasTCID50)ofthepurifiedproteinonC6/36wasdetected.Results：Prokaryoticexpressionrecombinantvector,pET28a(+)-Eb,wassuccessfullyco

5、nstructed.SDS-PAGEassayshowedthatthegeneEpartialsequencecouldbehighlyexpressedinBL21,andtheyieldswere29%oftotalbacterialproteins.Theexpressedproteinhadarelativemolecularweightof23KDa,andWestern-Blotindicatedthattheexpressionproductscouldspecificallyreactwithmonoantib

6、odyagainstdenguevirustype2.CytotoxicexperimentsinvitrosuggestedthattheproteinhadrelativelycytotoxicitytoC6/36,andtheTCID50was10~4.88/0.1ml.Conclusion：pET28a(+)-EbcontaininggeneEpartialsequencecanbehighlyexpressedinBL21.Theantigenicityoftheproducedproteinsprovideapote

7、ntialsourceofreagentfordenguevirusdiagnosis；TheexpressedproteinshavesomecytotoxicitytoC6/36.　　［Keywords］denguevirus;genes,E;geneorder;geneexpression5　　登革病毒（DengueVirus,DEN）是经埃及伊蚊和白纹伊蚊传播的黄病毒科黄病毒属病毒家族成员，有4种典型的血清型。DEN感染人类不仅可引起登革热（DengueFever，DF），还可引起登革出血热（Denguehemorrha

8、gicFever，DHF）和登革休克综合症（DengueShockSyndrome，DSS）。E蛋白是DEN的包膜蛋白,存在抗体依赖的增强感染作用表位和免疫保护表位。E蛋白全长约500个氨基酸,N端80%的氨基酸组成膜外区,C端20%的氨基酸构成跨膜疏水区[1]