rna酶保护试验试剂配制、操作流程与注意事项

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1、RNA酶保护试验试剂配制、操作流程与注意事项RNA酶保护试验((RNaseProtectionAssay,RPA)是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1.检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2.由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实

2、性较高。3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4.步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5.RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6.一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7.检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备1.GACUPOOL：取100mMATP、CTP、GTP各2.78μl、100mMUTP0.06μl，加DEPCH2O至100μl。2.杂交缓冲液：PIPES0.134g、0.

3、5MEDTA(pH8.0)20μl、5MNaCl0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPCH2O至10ml。3.RNase消化液：5MNaCl120μl、1MTris-HCl(pH7.4)20μl、0.5MEDTA(pH8.0)20μl、RNaseA(10mg/ml)8μl、RNaseT1(250U/μl)1μl，加DEPCH2O至2ml二、操作步骤1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。①设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7

4、启动子序列：T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性。②PCR先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。③探针合成标记与纯化在0.5ml离心管中加入下列试剂：RNasin(40U/μl)0.5μlGACUPOOLGAC(含GTP、CTP、

5、ATP各2.75mM,UTP61μM)2μl[α-32P]UTP(10μCi/μl)2.5μlDTT(二硫苏糖醇，0.1M)1μl5×转录buffer2μl模板(50ng/μl)1μlT7RNA聚合酶(15U)1μl混合后，短暂离心，37℃保温1hr。加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl，37℃15min，然后75℃10min以灭活DNAseⅠ和T7RNA聚合酶。加入：饱和酚50μl氯仿50μl酵母tRNA(2μg/μl)4μlDEPCH2O100μl室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心100

6、00g×2min。将上层液转移至另一0.5ml离心管中，再加入3MNaAc10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20℃静置30min。4℃离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4℃离心13500g×2min，弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。(参见本节电泳步骤)。2.杂交①RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。②取8μlRNA加入1-3μl探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml离心管中。③80℃保温2min，然后40-45℃下

7、杂交12-18hr。3.消化①杂交管于37℃保温15min，加入RNase消化液，37℃保温30min。②加入10%SDS10μl、10μg/μl蛋白酶K20μl，混匀，37℃保温10min。③加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。④转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3MNaAc15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20℃30min，4℃离心,135000g×10min。⑤弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。4、电泳与放射自显影①配制凝胶：(50ml)40%丙烯酰胺-亚甲