葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量

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1、实验二十葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量 目的要求 学习用葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量。 实验原理 葡聚糖凝胶（Sephadex）过滤法测定蛋白质分子量的原理，主要是依据这种凝胶具有分子筛作用，一定型号的凝胶具有大体上一定大小的孔径。在一定的凝胶柱内，凝胶孔隙所占的体积成为内水体积Vi，凝胶颗粒间的自由空间所占的体积称为外水体积V0。当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝胶内部，只需V0体积的洗脱液便可将其由一端洗脱到另一端；相反，如果样品体积小于孔隙，则需要V0＋Vi体积的洗脱液，才能将它们

2、由一端洗脱到另一端。中等分子（分子大小在上述两种极限之间）所需洗脱液体积介于两者之间，Ve＝V0＋KdVi（0

3、其洗脱体积，并以洗脱体积Ve对分子量的对数logMW作图，可获得一条标准曲线。未知分子量的蛋白质在相同条件下层析，根据其洗脱体积即可在标准曲线上求得分子量。三个不同大小分子组份上柱洗脱曲线示意图  本方法测分子量设备简单，结果处理方便，因此应用较广泛。但本方法仅适用于轴比相近似为球状蛋白，对轴比大的纤维蛋白不适用；对含量大于5%的糖蛋白因有较大水合作用，测得分子量偏高；对含铁蛋白测定数据偏低。 Ve对logMW作图   由于Ve与柱的大小有关，如果用Ve/V0对logMW作图，同样可得一线性关系的标准曲线，且可消

4、除柱的大小和吸附效应的误差。 1.细胞色素c2.核糖核酸酶3.肌红蛋白4.α－胰凝乳蛋白酶5.胰蛋白酶6.胃蛋白酶7.过氧化物酶8.卵清蛋白9.血清白蛋白10.铁蛋白Ve/V0对logMW作图    试剂和器材 一、试剂洗脱液：0.05MTris-HCl缓冲液，pH7.5，0.1MKCl溶液：称取12.12gTris，15gKCl，先用少量无离子水溶解，再加入6.67ml浓HCl，水定容至2L。蓝色葡聚糖2000；SephsdexG-100；N-乙酰酪氨酸乙酯饱和溶液（以洗脱液饱和）。 二、材料牛血清白蛋白；卵清

5、蛋白；细胞色素c；核糖核酸酶； 三、仪器层析柱；紫外检测仪；自动分部收集器。  操作方法 一、溶胀凝胶取SephadexG-10015g，加500ml蒸馏水室温溶胀三天（或沸水浴中溶胀5小时）。待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。溶胀平衡和漂洗净的凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。 二、装柱取2.6×60cm层析柱一根，底部用玻璃纤维或砂蕊滤板衬托，并要求滤板下的体积尽可能小（否则被分离的组份间重新混合的可能性就大，其结果影响层析的灵敏

6、度，降低分离效果）。在砂蕊滤板上覆盖一张大小与柱的内径相当的快速滤纸片。将柱垂直至于铁架上，然后在柱顶通过橡皮塞连接一长颈漏斗（漏斗颈直径约为柱直径的一半）。在柱中加水或洗脱液，并赶净滤板下方气泡，使支持滤板底部完全充满液体，然后将柱的出口关闭。把已经溶胀好的凝胶调成薄浆，从漏斗倒入柱内，胶粒逐渐扩散下沉，薄浆连续加入。当沉积的胶床至2～3cm高时，打开柱的出口，并注意控制操作压以均匀不变的流速直到胶装完为止。柱装好后，在床的上面盖上一张大小略小与柱内径的滤纸片，以防止样品中一些不溶物质混入床中。再以洗脱液平衡柱

7、层，直至层析的胶床高不变为止。柱装得是否均匀，可用蓝色葡聚糖上柱检验；如果色带均匀下移，说明柱子已装好，可以使用。层析柱的流速可借操作压即进出口液面的高度差来控制。凝胶床受操作压的影响极为明显。增加操作压虽能增加流速，但时间长久后，凝胶被压紧反而使流速减慢。各类凝胶能耐受的最大压力如下表所示： 型号压力极限（毫米汞柱）G-20010G-18035G-7550G-50～G-10>100 三、上样称取0.5mg蓝色葡聚糖2000（分子量200万以上）四份，分别放在称量瓶中，再称取标准蛋白牛血清白蛋白（分子量68000

8、），卵清蛋白（分子量43000），核糖核酸酶（分子量13700），细胞色素c（分子量11700）各10mg，分别放在各称量瓶中；各瓶加入N-乙酰酪氨酸乙酯饱和溶液0.5ml，使混合物溶解后分别上柱。样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关闭出口，用滴