水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达

《水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达【摘要】目的：构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂（leechderivedtryptaseinhibitor,LDTI）原核表达载体,并在大肠埃希菌［BL21(DE3)］中高效表达重组蛋白。方法：以含有目的核酸序列的质粒为模板，通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列，构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pET28aLDTI重组质粒亚克隆，进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析，然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导，以Trici

2、neSDSPAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达。结果：成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28aLDTI，并获得相应的融合蛋白；本实验证明，LDTI在大肠埃希菌工程菌中高效表达，在温度为33℃，IPTG浓度为0.7mmol，诱导时间为1h，所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右。结论：成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达，为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础。【关键词】构建；原核表达；水蛭源性类胰蛋白酶

3、抑制剂［Abstract］Objective:ToconstructtheprokaryoticexpressionvectorofLDTIgeneandexpressLDTIproteininE.coli［BL21(DE3)］.Methods：A141bpfragmentoftheLDTIgeneplifiedbyPCRtechniquefromthetemplateoftheplasmidcontainingLDTIgene,thenitplifiedanddigestede,thetarge

4、tfragmentidpET28a,therebinantplasmid109.Thefragmenteandnucleotidesequencing.TherebinantexpressionplasmidcontainingLDTIgeneedintoE.coliBL21(DE3)andthetargetproteinexpressionedbyTricineSDSPAGEandD18T载体购自日本TaKaRa公司，含有目的LDTI编码序列的质粒由大连TaKaRa公司合成。大肠埃希菌JM

5、109，BL21(DE3)及表达载体pET28a为本校张忠芳老师馈赠。1.1.3核酸序列分析由上海英骏公司采用ABI377全自动测序仪器和配套的试剂盒测序。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据LDTI氨基酸序列推导出目的核酸序列并设计引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物序列：5′GGCATATGAAAAAAGTTTGCGC3′；下游引物序列：5′TAAGCTTTTACGTCGGGCAGGA3′。其中，为了方便克隆操作，在上下游引物中加入了限制性内切酶NdeⅠ，HindⅢ的酶切位

6、点，以便LDTI核酸片段定向克隆于相应的酶切位点上，保证阅读框架的正确性和完整性。此外在限制性内切酶HindⅢ，NdeⅠ酶切位点引入1至2个保护性碱基，以利于酶切反应进行。1.2.2LDTI片段扩增PCR反应体系为：DNA0.3μl，Taq酶2U，10×缓冲液2μl，dNTP1.6μl和引物0.4μl，加DDW至总体积20μl。PCR扩增条件：预变性94℃2min，94℃1min→62℃1min→72℃1min，25个循环，反应结束前72℃延伸10min。1.2.3构建T载体克隆按照凝胶纯化试剂盒

7、操作流程纯化PCR产物后与T载体连接，转化感受态大肠埃希菌JM109，经过蓝白斑筛选，挑选单个阳性克隆，在100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中过夜生长，提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。1.2.4构建原核表达载体亚克隆将T载体克隆双酶切后目的片段及pET28a双酶切后片段经琼脂糖凝胶电泳，回收，按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物，将纯化后的两核酸片段16℃连接，过夜。转化感受态细菌JM109，挑取阳性克隆，接种于含100μg/ml卡那霉素的LB培养基中过夜生长，按照质粒小量抽提试剂盒说明书

8、提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。1.2.5LDTI蛋白的诱导表达将重组质粒pET28aLDTI转化BL21(DE3)，挑取单个菌落，接种于3ml含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养过夜。以1∶50比例取过夜培养物接种于含100μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，至其D(600nm)=0.6时加入IPTG（终浓度0.7mmol/L）继续培养，分别于1，2，3，5，10h取1ml菌液。以不含重组质粒的空白菌培养物和未加IPTG诱导的重组质粒转化细菌培养物为对照。1.2.6L