溶解肠杆菌yh16 抗汞操纵子的克隆与分析

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1、溶解肠杆菌YH16抗汞操纵子的克隆与分析【摘要】目的通过对从污染地区分离出的抗汞菌株——溶解肠杆菌YH16的研究，获得新的抗汞操纵子基因，为汞污染环境的微生物修复打下基础。方法通过质粒消除实验确定抗汞基因的位置，通过构建基因文库的方式筛选获得新的抗汞操纵子基因(mer)。结果YH16的抗汞操纵子位于质粒上，该操纵子长达6048bp，由7个ORF组成，依次为merT、merP、merC、merA、merD、tnpA、tnpA，与典型的Tn501mer操纵子和Tn21mer操纵子相比，缺少merR。结论获得了缺少merR基因的mer操纵子，具有理论研究意义，并为抗汞工程菌的构建打下基础。【

2、关键词】抗汞质粒;质粒敲除;mer操纵子;汞污染)Abstract:ObjectiveInordertoobtaintheHg?resistanceoperon,thegenelibraryofmercury?resistancestrain:Enterobacterdissolvenssp.YH16id?knockoutexperimenthadbeenusedtoposittheHg?resistancegene,thegenelibraryandbioinformaticsanalyzingtoolshadbeenusedtoscreentheHg?resistancegene.

3、ResultsThemergenesidandorganizedasmerT，merP，merC，merA，merD，tnpA，tnpA,closelyrelatedtothatlocatedinTn501andTn21,butlackingmerR.ConclusionAdifferentmeroperongeneightlayabasisforthefurtherstudyonthestructureanalysisandgenecloneofit.　　Keyid;plasmid?knockout;meroperon;Hgpollution　　随着工农业生产的发展和人类活动的不断加

4、剧，环境中汞污染物的排放量与日俱增。环境中的汞可被转化为毒性很强的甲基汞，有可能通过食物链富集并进入人体，对神经、免疫、生殖系统等造成功能上的损害，从而威胁人类健康[1]。自然界存在的抗汞细菌是平时解决环境中汞污染的主角，它们可以将环境中的有机汞降解为无机汞，并进一步还原为毒性低、易挥发的金属汞[2]。目前已经公认微生物对汞及其化合物的抗性通常是由细胞内质粒或跳动基因上复杂转座子中的抗汞性操纵子(mer操纵子)决定的[3]。　　在以往的研究中，通过连续富集培养与驯化的方式，获得了一株具有高抗汞活性的菌株Enterobacterdissolvenssp.YH16，其对HgCl2的24h汞

5、去除率达70%[4]。进一步研究发现，YH16的mer操纵子位于其质粒上，通过构建YH16菌株质粒基因文库，获得了mer操纵子基因，为降解汞生物工程菌的构建奠定了基础，对解决环境中的汞污染问题具有重要的应用意义。　　1材料与方法　　1.1培养基　　LB培养基与LA培养基按照分子克隆手册配制[5]。　　1.2菌株　　大肠杆菌XL1?Blue[hsdR17,supE44,recA1,endA1,gyrA46,thi?1,relA1,lac/F?]由本实验室保存。抗汞菌株Enterobacterdissolvenssp.YH16由本实验室从汞污染土壤中分离获得。pBluescriptsk(-

6、)质粒购自TaKaRa公司。　　1.3酶和试剂　　各种限制性内切酶、DNAmarker、X?Gal、IPTG购自TaKaRa公司，T4连接酶、去磷酸化酶购自MBI公司。其他生物化学试剂均为国产分析纯。　　1.4菌株Enterobacterdissolvenssp.YH16的质粒消除　　用EB对YH16的质粒进行消除，处理浓度与温度时间分别为20mg/L，45℃，24h;20mg/L，30℃，24h;10mg/L，45℃，24h。将处理后的培养液稀释并涂LB平板，30℃培养过夜后影印到含HgCl220mg/L的LB平板上，30℃培养24h观察结果，分别挑取抗汞活性丢失菌株与未丢失抗菌活性

7、菌株以碱裂解法小量提取质粒DNA，电泳检测。　　1.5抗汞质粒的转化　　Enterobacterdissolvenssp.YH16质粒的提取，XL1感受态的制备与转化参照分子克隆手册进行[5]。选择培养基为含有HgCl220mg/L的LB培养基。　　1.6抗汞质粒基因文库的构建　　参照分子克隆手册提取Enterobacterdissolvenssp.YH16质粒和pBluescriptsk(-)质粒[5]。YH16质粒DNA首先经HindⅢ、B