基于离子交换层析分离纯化人结合珠蛋白的研究

《基于离子交换层析分离纯化人结合珠蛋白的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、基于离子交换层析分离纯化人结合珠蛋白的研究结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)，又称触珠蛋白，于1938年由两名法国人Polonovski和Jayle首次发现。Hp是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，主要由肝脏合成，广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及体液中。Hp作为急性期反应蛋白，当炎症、感染、创伤、恶性肿瘤等发生时在血液循环中水平会升高4～6倍，在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定的过程中起着重要作用。Hp在人血浆中含量较丰富，正常血浆水平可达0.3～2g/L。人Hp主要存在3种表现型，即Hp1-1，Hp2-1，

2、Hp2-2。Hp基本结构为四聚体，由两条β链和两条α链(α1链或α2链)组成，β链相对分子质量(Mr)约为40103，α1链约为9103，α2链为17103。其中，Hp1-1由2条β链和2条α1链组成;Hp2-1由2条β链，1条α1链和1条α2链组成;Hp2-2型由2条β链和2条α2链组成。由于α2链有一个特殊的巯基，可形成二硫键，形成大分子量的聚集体，如单体、三聚体、四聚体、五聚

3、体、六聚体甚至更大的聚集体。所以这些聚集体主要存在于Hp2-1和Hp2-2中，而Hp1-1主要以单体的形式存在。Hp主要功能是与游离的血红蛋白(hemoglobin，Hb)结合并促使其从循环系统清除。在慢性贫血、输血反应或烧伤等急性情况下，Hp能与红细胞溶解释放出的游离Hb结合，形成复合物，促使游离Hb被机体清除，避免对肾脏的损伤。此外，Hp还具有抗氧化、抑制前列腺素合成、保护一氧化氮、免疫调节等功能，因此具有重要的医用价值。早在1985年，日本就批准Hp浓缩制剂用于临床，主要用于治疗烧伤、烫伤、输血、体外循环心脏直视术等引起的溶血反应伴血红蛋白血

4、症或血红蛋白尿等。Cohn组分Ⅳ是低温乙醇法生产白蛋白过程中产生的一种副产品，富含许多具有药用价值的蛋白，如白蛋白、转铁蛋白、α1-蛋白酶抑制剂、Hp、抗凝血酶Ⅲ等，但在工业生产中一般被废弃，造成严重的资源浪费。本研究以血浆蛋白生产过程中的Cohn组分Ⅳ为起始原料，采用利凡诺与硫酸铵沉淀组合的前处理方法，后续又采用离子交换层析的方法成功分离纯化Hp，为进一步建立简单易行的Hp生产工艺奠定基础，有助于提高Cohn组分Ⅳ的综合利用率。　　1材料与方法　　1.1材料　　Cohn组分Ⅳ溶解液(华兰生物工程股份有限公司惠赠);人血红蛋白(实验室制

5、备);离心机(Heraeus公司，型号:BiofugePrimeR);超滤系统(北京旭邦膜设备有限责任公司，型号:UF-30K);QSepharoseFastFloageQuant350)(均GE公司);层析柱(25mm40cm，上海康华生化仪器制造公司);垂直电泳仪(Bio-Rad公司，型号:mini-PROTEANTetra)、转印仪(北京六一生物科技有限公司，型号:40D)、水浴锅(PharmaciaBiotech公司，型号:MultiTempⅢ)、兔抗-Hp抗体(博士德生物公司)、HRP标记的山羊抗兔二抗(中杉金桥)，BCA蛋白含量检测试剂

6、盒(鼎国昌盛生物技术公司)，其他试剂均为国外或国产分析纯。　　1.2Cohn组分Ⅳ前处理　　将Cohn组分Ⅳ溶解液200ml用醋酸铵溶液(0.05mol/LpH8.5)600ml稀释至蛋白浓度约为50mg/ml(BCA法测定)，调pH为8.5，然后加入2%利凡诺至终浓度8mg/ml(约532ml)，室温搅拌20min，4℃静置2h，弃沉淀，收集上清。加入活性炭吸附，并用滤板过滤，收集滤液调pH为7.0。加入硫酸铵至50%饱和度(约344g)，室温搅拌20min，4℃静置30min。然后4℃，8500g离心30min。取沉淀并溶于500mlNaAc-

7、HAc(0.05mol/LpH5.5)缓冲液中，进行超滤脱盐(截留相对分子质量为30103)，即为前处理样品。　　1.3QSepharoseFastFlool/LpH5.5)平衡QSepharoseFastFlo2.5cmI.D，CV=30ml)，流速为10ml/min。将前处理样品用NaAc-HAc平衡液10倍稀释(约3.5mg/ml，共300ml)后进行上样，流速10ml/min。待上样结束后用平衡液继续流洗，去除与层析柱未结合或结合不紧密的蛋白，然后分别用含0.025、0.05、0.1、0.2mol/LNaCl溶液进行分步洗脱，层析过程均以2

8、80nm紫外波长进行监测，收集各个峰值范围的洗脱液，并进行鉴定分析。　　1.4SDS-PAGE分析　　将各峰值范围洗脱蛋白