知母宁抗乙肝病毒作用的体内外实验研究

《知母宁抗乙肝病毒作用的体内外实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、知母宁抗乙肝病毒作用的体内外实验研究【摘要】目的：观察知母宁的抗乙肝病毒作用。方法：观察不同浓度知母宁对体外培养的2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用及对乙肝模型鸭DHBV-DNA的影响。结果：知母宁浓度为4mg/mL时对2.2.15细胞分泌HBeAg有明显的抑制作用；以200mg/kg治疗乙肝模型鸭10d后DHBV-DNA水平明显降低。结论：知母宁有抗乙肝病毒的作用，其机制可能与抑制HBV-DNA的复制有关。【关键词】知母宁乙肝病毒2.2.15细胞DHBV-DNAAbstractObjective：Tostu

2、dytheeffectofChinoninonHBVinvivoandinvitro.Methods：ThelevelofHBsAgandHBeAgsecretedfromHepG2.2.15cellsandthecopiesofDNAofduckhepatitisBvirus（DHBV）modelsg/mLinvitro.Invivo，chinonincandecreasedsignificantlyDHBVlevelofduckmodelafter10daystreatmentg/kg.Conclusion：Chinoni

3、nhastheeffectofdecreasingthesecretionofHBeAg，ayberelatetorestrainingtheduplicationofHBV-DNA.Keyega公司生产）；α-32P-dCTP（北京亚辉公司生产）；DHBV阳性血清。1.1.3实验仪器细胞培养瓶、96EM培养基培养于细胞瓶中，长满后，用0.06%的胰蛋白酶消化2min~3min，弃消化液，加少量DMEM培养液轻轻吹打，制成3×105/mL单个细胞悬液，种于96孔细胞培养板中，每孔0.1mL，37℃，5%CO2，48h，细胞贴壁

4、后用于实验。1.2.2HBeAg和HBsAg测定将Chinonin配成多个浓度（从16mg/mL浓度开始倍比稀释），加于已滴有2.2.15细胞的96孔细胞板中，0.1mL/孔，每浓度4孔；设无药细胞对照组4孔及空白对照组4孔，每孔加入0.1mL2%DMEM。加药培养10d后，吸取培养液于另一96孔板中，即行HBeAg和HBsAg测定，用酶标仪以450nm波长测定OD值（了解抗原的分泌情况）。原96孔板中用MTT染色，每孔加0.4g/LMTT0.1mL，37℃，5%CO2孵育4h，弃上清后加DMSO0.1mL溶解，然后以490n

5、m波长比色测定OD值（了解细胞存活情况）。1.2.3鸭乙肝模型的建立及给药1d龄华南麻鸭，足静脉注射DHBV阳性血清，每只0.2mL，1g/kg灌胃）、Chinonin低剂量组（100mg/kg灌胃）。1.2.4DHBV-DNA检测分别在给药前及给药后5d、10d，停药后3d，用斑点杂交法检测DHBV-DNA。（1）探针的标记：DHBV-DNA探针标记采用缺口平移法，按Promego药盒说明书稍加改动进行。（2）斑点杂交：①点样：将硝酸纤维素膜用去离子水和10×SSC溶液各浸泡30min，室温晾干后点膜，40μL/样，真空抽滤

6、；②变性：将膜分别置于变性液I10min，变性液II10min，变性液III10min，将变性后的膜室温晾干，置80℃烤箱中2h，烤干；③预杂交：将膜置3×SSC-0.1%SDS10mL中，65℃，30min，换10×Dendhart-0.1%SDS10mL中，65℃，4h或过夜；④杂交：弃预杂交液，于杂交袋中加入杂交液，封口后42℃，36h~48h；⑤洗膜，用医用X线胶片，-70℃感光5d后显影、定影。1.2.5计算公式及统计方法数据结果以（x±s）表示，组间均数比较采用t检验，以SPSS9.0统计软件处理，显著性水平α=0

7、.05。2结果2.1Chinonin对细胞的毒性作用结果见表1。由表1可见，Chinonin浓度在16mg/mL、8mg/mL时对细胞的毒性较大，破坏率均＞50％，而4mg/mL时毒性明显减弱，破坏率为24.03％，且破坏率随浓度的下降而下降。经计算，Chinonin的半数毒性浓度（TC50）为6.318。为排除药物对HBeAg、HBsAg的抑制作用是由于对细胞的毒性所致，故选择TC50以下的浓度来评价药效。当Chinonin浓度为4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL时与细胞对照组比较均无显著差异，提示这

8、4个浓度对细胞没有明显的毒性作用。2.2Chinonin对抗原的抑制作用结果见表2。由表2可见，Chinonin在浓度为16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL时对HBeAg均有较好的抑制作用，与细胞对照组比较，P＜0.05。经计算，半数有效浓度（IC50）＝