注射用重组双功能水蛭素产品质量研究

《注射用重组双功能水蛭素产品质量研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、注射用重组双功能水蛭素产品质量研究张艳玲，莫炜Δ，王龙生，杨新英，宋后燕【摘要】本实验室构建了分泌型高效表达重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin)的工程酵母，经发酵、纯化，获得重组双功能水蛭素纯品，其原液经质量分析，符合国家静脉注射用药的标准，可以用于制备静脉注射用粉针剂。【关键词】注射用重组双功能水蛭素；质量研究【Abstract】Theexpressionplasmid，HD-pPIC9K，entedfor3days，andthepurifiedRGD-Hirudineasureduptostandardofinj

2、ection.天然水蛭素是凝血酶的特异抑制剂，从医用水蛭的唾液腺中提取而得，可与凝血酶形成摩尔比为1:1的非共价相结合的可逆复合物，对凝血酶有很高的亲和力，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，抑制纤维蛋白的形成，因此，低浓度的水蛭素可有效地抑制血液凝固［1］。我们在保留天然水蛭素原有的生物学作用的基础上，将RGD编码顺序融合在天然水蛭素cDNA基因中［2～5］。构建了含RGD编码顺序的水蛭素cDNA克隆HD-pPIC9K，表达质粒转化毕赤酵母后，经筛选获得高表达菌株，并建立工程菌株，实现了高效、分泌型表达(另文发表)。本文重

3、点报道重组双功能水蛭素原液的质量研究。1材料与方法1.1抗凝比活性测定1.1.1试剂的配制0.5%纤维蛋白原：纤维蛋白原(上海莱士血制品有限公司)0.5g，以100ml生理盐水溶解。凝血酶：中国生物制品检定所制备的凝血酶，依照标示量，用生理盐水复溶后成100NIU/ml。阴性对照：以生理盐水为样品，凝血酶加入后立即凝固。标准对照：德国Hochest公司生产的Refludan，按照其标示活性溶解分装成1600ATU/支(即0.1mg/支)，冻干，具体操作步骤按说明书进行。1.1.2方法凝血酶滴定法［1］(所有过程在37℃水浴

4、中操作)。1.1.3抗凝活性计算抗凝活性(ATU/ml)=(n-1)×100×稀释倍数，n为添加凝血酶的次数，1为扣除本底1次(即最后一次加入凝血酶，纤维蛋白原凝固)，100为凝血酶活性单位100NIU/ml，稀释倍数为所测定样品的稀释倍数。1.1.4蛋白含量测定按改良Log)＝单位抗凝活性(ATU/ml)/单位蛋白含量(mg/ml)。1.2抗血小板聚集比活性测定［7］1.2.1试剂的配制ADP：Sigma公司，用生理盐水溶解并稀释，配成400μmol/L贮存液，-20℃保存。1.2.2血小板来源正常志愿者。1.2.3仪器

5、血小板聚集仪(上海斯隆医电设备有限公司)。1.2.4方法按说明书操作。1.2.5结果判定血小板聚集抑制率：以未用药测得的血小板聚集率作为空白对照，体外给药后，测得的血小板聚集率除以空白对照所得的比值为相对聚集率，此相对聚集率与1的差值即血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率＝1－(用药后测得的血小板聚集率/空白对照)1.3纯度测定高效液相色谱法(HPLC)［6］。色谱主机：SHIMAZU，LC-10AD；色谱柱：DELTAPAKC18-300A，3.9mm×15cm；流动相：A：水+0.1%TFA；流动相：B：90%乙腈+0.

6、1%TFA；梯度：100min内，流动相B从0%到100%；流速：0.2ml/min；样品浓度：1mg/ml；上样量：20μl；检测波长：280nm。1.4肽图分析TPCK处理的胰蛋白酶酶解RGD-Hirudin样品和理化对照品，分别以C8柱反相层析柱，0.1%TFA-H2O/0.1%TFA-乙腈为流动相，214nm波长检测，并用质谱测定各肽段分子量，计算总分子量［6］。1.5紫外光谱扫描在200～400nm波长范围内扫描RGD-Hirudin样品和理化对照品［6］。1.6残留工程菌蛋白含量测定1.6.1Pichia酵母全

7、菌蛋白制备Pichia酵母在YPD培养基中30℃培养，菌体超声波/机械破碎，得蛋白初提物水溶液，Log/只)，体积比1:1与完全福氏佐剂混合。免疫方法：背部皮下多点注射(1ml/点)，每周1次。多抗滴度：免疫4周后，取血，分离血清，双扩散法测定其效价，若高于1:16，即颈动脉放血，分离血清(抗酵母全菌蛋白多抗)；若低于1:16，则继续按上述方法免疫动物，直至效价高于1:16为止。1.6.3残留工程菌蛋白含量测定(ELISA)Pichia酵母全菌蛋白系列浓度：100ng/ml、80ng/ml、60ng/ml、40ng/ml、

8、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、0ng/ml。样品：1mg/ml。一抗：即自制抗Pichia酵母全菌蛋白多克隆抗体，稀释度为1:100。二抗：华美试剂公司，羊抗兔IgG-HRP，稀释度为1:1000。显色方法：邻苯二胺/H2O2/pH5柠檬酸缓冲液。比色方法：测定波长：492nm，参比波长