一体化层状梯度修复体用于骨软骨组织工程的实验研究

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1、一体化层状梯度修复体用于骨软骨组织工程的实验研究作者：白雪东，胡蕴玉，严乐平，任力，吴刚，李丹，孙效棠，白建萍【摘要】［目的］探索胶原/壳聚糖/纳米β磷酸三钙一体化层状梯度修复体在组织工程中用作骨软骨缺损修复的可行性。［方法］以Ⅰ型胶原、壳聚糖、纳米β磷酸三钙（βTCP）为基本原料，采用无毒交联并通过冷冻干燥法成型；扫描电镜观察，测定支架材料的孔径、孔隙率以及交通孔情况；分离扩增兔骨髓间充质干细胞（BMSC），将BMSC接种于材料上，扫描电镜观察细胞在材料上的黏附状态，MTT法测定细胞在材料上的生长曲线；以软骨诱导液体外

2、诱导细胞支架复合物向软骨分化，2周后植入自体股部肌袋，6周取材，HE、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化效果。［结果］材料疏松多孔，孔径大于100μm，孔隙率大于95％。细胞在材料上黏附状态良好，并且增殖迅速。BMSC材料复合体经体外三维诱导后可在自体异位向软骨分化。［结论］Ⅰ型胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化层状梯度修复体具有良好的孔隙结构和生物相容性，有望成为一种新型的组织工程支架材料用于骨软骨缺损修复。【关键词】组织工程；骨软骨；骨髓间充质干细胞；胶原；纳米β磷酸三钙Abstract：［Objective］T

3、oexplorethepotentialofanovelcollagenI/chitosan/Nanoβtricalciumphosphate(βTCP)bilayeredscaffoldforbEingusedintissueengineering(TE)ofosteochondralrepair.［Method］Bilayeredscaffoldsethod.Theporesize,porosityandinterporesofthescaffoldicroscopy(SEM).Rabbitbonemesenchyma

4、lstemcells（BMSC）plified,theninoculatedontothescaffold.BySEMscanning,theconditionofthecellsadheringontothescaffoldinedusingMTTmethod,andthegroplantedintomusclepouches2munohistochemistry.［Result］Thescaffoldpossessedhighporosityandproperporesize,theporosityaterialofTEu

5、sedforosteochondralrepair.Keyesenchymalstemcells(BMSC);collagen;Nanoβtricalcium组织工程学的发展为软骨损伤修复提供了新的方法，可有效地解决移植物来源以及供区损伤问题，并且移植物可以在体外任意塑形，以适应损伤部位的需要〔1〕。软骨缺损的修复包含2个主要方面：（1）以功能性修复组织填充缺损；（2）修复组织与周围宿主软骨和骨的整合〔2〕。目前软骨组织工程中存在的一个突出问题是移植物与宿主组织间缺乏稳固的锚定，单纯依赖软骨软骨界面微弱的连接往往难于达到满

6、意的修复效果〔3〕。为有效解决移植物与宿主组织的整合问题，作者研制了一种新型组织工程骨软骨一体化材料——胶原/壳聚糖/βTCP一体化层状梯度修复体。该材料在结构上分为上层的软骨部分和下层的软骨下骨部分，但整个材料一体化交联，避免了软骨与骨部分在修复过程中分离。凭借骨组织之间快速而牢固的整合，有望使整个修复体在早期稳固地锚定于缺损区，为关节软骨的修复提供良好的稳定性和机械支持。本实验对该组织工程骨软骨一体化修复体的一般性能以及体外生物相容性进行了研究，并且通过体外诱导以及自体异位实验初步探讨其用于组织工程骨软骨损伤修复的可行性

7、。1材料和方法1.1胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化层状梯度修复体的研制支架材料由华南理工大学生物材料研究所研制提供，以Ⅰ型胶原、壳聚糖为基材,与具有良好生物活性的βTCP粉体共混交联，经冷冻干燥成型。上层为胶原/壳聚糖，下层为胶原/壳聚糖/βTCP，无机粉体含量由下到上呈梯度变化。1.2支架材料的形态和孔隙率以排水法测材料的孔隙率，扫描电镜观察材料的孔隙大小以及孔隙贯通情况。1.3MTT法测细胞在支架材料上的增殖活性取3个月龄日本大耳白兔，体重2.1kg，常规麻醉消毒后自胫骨平台下0.5cm处以18号穿刺针穿刺，两侧各抽取

8、骨髓2～3ml，小心加入预装有等体积percoll工作液（密度1.073）的离心管，以2000r/min离心25min后收集有核细胞层，重悬于含10％新生牛血清（GIBCO）的高糖DMEM培养液中，接种于100ml培养瓶，于37℃、体积分数为5％CO2的孵箱中培养。3d后首次