酵母菌发酵川乌、附子的初步研究

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1、酵母菌发酵川乌、附子的初步研究作者：葛喜珍刘洁苏建树，郑来丽，李利辉，赵有玺,田平芳【摘要】目的探讨酵母菌发酵对川乌、附子(黑顺片)中总生物碱含量的影响。方法采取酵母菌直接发酵和以面粉为基质进行酵母菌扩增，之后再与川乌、附子混合两种发酵方法，水煎提取、测定总生物碱含量和浸膏得率。结果酵母菌直接发酵生物碱含量最高，酵母菌+面粉再与川乌、附子混合发酵后生物碱含量略低，但浸膏得率最高，两种方法发酵均高于传统水提法。结论酵母直接发酵川乌、附子能明显提高总生物碱含量和浸膏得率。【关键词】川乌;附子(黑顺片

2、);酵母发酵;总生物碱;浸膏得率川乌为毛茛科乌头属植物乌头的干燥主根,具有祛风除湿，散寒止痛的功效，附子为子根，具有回阳救逆，助阳补火，散寒止痛的作用。川乌、附子两药材同源，均为临床常用品。川乌、附子的主要成分之一生物碱是祛风除湿、散寒止痛的有效成分，同时又是导致中毒的成分，由于乌头碱致毒事件频频发生，制约了乌头属中药的应用[1],《中国药典》2005版规定川乌、草乌的用量减至35g，以减量减毒，这种做法以疗效为代价换取用药安全。如何通过简单设备、方便操作、低成本加工保证川乌、附子的疗效，同时又

3、降低其毒副作用，达到减毒增效是现代中药研究的主要课题之一[2]。发酵是传统中药加工的重要方法之一，发酵作为一种加工工艺不但改变煎、煮、熬、炼、蒸、浸的传统工艺，而且使药效提高、药性发生改变，在有毒药物的研究方面蕴藏着极大潜力[3]。为此本研究尝试以无毒副作用的酵母菌发酵川乌、附子，阐明此菌发酵对附子、川乌中总生物碱含量的影响，为下一步药效和毒理学研究提供理论依据。　　1材料与仪器　　1.1材料制川乌、附子(黑顺片)均购自河北安国长安药材行，经联合大学生物化学工程学院制药工程教研组鉴定为正品;安琪

4、高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司产品;蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司产品;葡萄糖，北京化学试剂公司产品;溴甲酚绿(BCG)试液依照2005年版《中国药典》配制;乌头碱对照品，中国药品生物制品检定所产品，批号：11072-200410。　　1.2仪器超级洁净工作箱DL-CJ-2ND(北京东联哈尔仪器制造有限公司);立式压力整齐灭菌器LS-835L型(江阴滨江医疗设备厂);新型恒温振荡器ZHl水中。　　YPD固体培养基：蛋白胨20g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，琼脂粉2

5、0g于1000ml水中。　　酵母菌活化培养：固体培养基高压灭菌后，倒入平板，23h凝固，待用。用少量无菌水溶解干酵母成膏状，挑取膏状酵母，接种后放入29℃培养箱培养3d待用。　　酵母菌扩大培养：挑取已活化的菌体，深入液体培养基中轻轻搅拌，于29℃摇床培养3d，待用。　　川乌、黑顺片发酵：无菌条件下，将活化培养的200ml酵母菌悬液分别与高压灭菌的川乌40g，黑顺片40g，川乌20g+黑顺片20g，粉末搅拌，根据预试验放入29℃摇床培养5d，菌悬液颜色变深。　　2.3提取分别取发酵前后的川乌、黑顺

6、片各40g，川乌20g+黑顺片20g，用300ml蒸馏水煮3次，时间分别为1.5，1，0.5h，过滤，合并滤液,离心，取上清，减压蒸发至100ml。分别取上述浓缩液50ml，用氨试液调pH=9，之后依次用乙醚25，20，15，10ml萃取4次，上层溶液水浴蒸干，取氯仿共5ml转移残渣至分液漏斗，以HCl(0.1mol/L)5，5，5ml萃取3次，合并上层液，氨试液调pH=9，再用三氯甲烷10，10，10ml萃取3次，取下层，水浴蒸干。用0.01mol/LHCl将残渣转移定容至10ml容量瓶中，进

7、行总生物碱检测。　　2.4总生物碱检测　　2.4.1乌头碱对照品溶液配制精密称取乌头碱标准品2.53mg置10ml容量瓶，以0.01mol/L的盐酸溶液定容，作为对照品。　　2.4.2检测波长确定取一定量的对照品溶液于100ml分液漏斗中，加入pH=3.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液5.0ml，BCG试液2.0ml，氯仿10.0ml，加适量蒸馏水使水相成10ml，充分振摇均匀，静置1h分层。将下层氯仿液放入装有少量无水硫酸钠的10ml容量瓶中。另取10.0ml氯仿置100ml分液漏斗中,同法操作

8、，作为空白对照，于200700nm波长范围内进行光谱扫描。结果表明本品在412.5nm处有最大吸收峰，在此波长下空白对照的干扰比较小。见图1。　　1-样品;2-标准品;3-阴性样品　　图1乌头碱-BCG紫外可见光谱　　2.4.3标准曲线的制备精密量取乌头碱标准溶液，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9ml，分别置于干燥分液漏斗(100ml)中，加缓冲剂5.0ml，溴甲酚绿溶液2.0ml，蒸馏水定容10.0ml，摇匀。再精密加入氯仿10.0ml,充分振摇3min,静置1h后，分取氯仿液至