丹参对冻融小鼠卵巢同种异体移植后卵泡存活率的影响及其作用机制

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1、丹参对冻融小鼠卵巢同种异体移植后卵泡存活率的影响及其作用机制：林海燕熊成容朱琴吴丹丹唐飞周颖【摘要】目的：探讨丹参注射液对冻融小鼠卵巢同种异体移植缺血低氧损伤的保护作用及可能机制。方法：收集B6C2F1第1天新生(D1)小鼠卵巢，慢冻速融后移植至B6C2F1代8～12周雄鼠的肾被膜下，移植后小鼠按给药不同分为对照组和丹参组，分别于移植后1d（24h）、2d(48h)和14d回收移植物，进行超氧化物歧化酶（SOD）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的RT-PCR半定量测定，同时移植后14d回收移植物做HE染色全卵巢卵泡计数及PA免疫组化分析。结果：移植后各时间段

2、卵巢组织SODmRNA的表达，丹参组均高于对照组，而iNOSmRNA的表达则均低于对照组。移植后14d回收全卵巢总卵泡数，丹参组（2709±234）多于对照组（1889±202），P＜0.05；卵泡存活率，丹参组（64.1%）显著高于对照组（44.7%），P＜0.05。结论：丹参注射液可能通过上调SODmRNA的表达，抑制iNOSmRNA的表达而改善冻融小鼠卵巢同种异体移植缺血低氧性损伤，从而提高卵泡的存活率。【关键词】丹参；卵巢；冷冻保存；移植Abstract:Objective:Toexploretheprotectiveeffectsofdanshen

3、injectiononischemiainjuryinheterotopicallygraftedneouseovaries.Methods:OvariesfromB6C2F1neicealemice.Themiceice1d，2dand14dovedtoassessthemRNAexpressionsofSODandiNOS14dmunohistochemicallyforPA.Results:SOD-mRNAexpressionofovariantissueinthedurationperiodaftertransplantationRNAexpress

4、ionberoffolliclesin2orethanthatofcontrolgroup（1889±202）.Thereprovementinsurvivalratefrom44.7%to64.1%ifhostanimalsinisteredayimprovedthesurvivalrateofovariesbyreducingischeamiainjuryinheterotopicallygraftedneouseovariesRNAexpressionandthedecreaseofiNOS-mRNAexpression.Keya公司）；兔抗增殖细胞核

5、抗原（PA）多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；反转录试剂盒（TAKARA）；KRYO10-22seriesⅢ程序冷冻仪(英国Planer公司)；ThemoHybaidPCR仪(英国TECHNE公司)。1.3实验方法1.3.1卵巢的收集，低温保存和解冻：断颈处死1日龄受体雌鼠，体视显微镜下分离卵巢，放入L15液中，去掉卵巢周围的包膜，卵巢转移至冷冻液（L-15、10%FBS和1.5mol/LDMSO)中，再把10～12枚卵巢转移至0.25mL的塑料麦管中，并用聚乙烯氯化物粉末密封细管。采用Gosden的慢冻方法进行冷冻，最后投入液氮

6、保存。卵巢移植时把冷冻保存1周至6个月的卵巢麦管从液氮中取出，在空气中放置20s，然后快速投到室温水中10～20s，取出卵巢转移至L15(含10%FBS)液中。在L15液(含10%FBS)中多次漂洗以去除其中的抗冻剂。1.3.2卵巢移植：8～12周龄的雄鼠作为受体，麻醉后背部切开显露双侧肾脏，用锐利镊在肾囊上撕开一个洞，把解冻的卵巢塞入到肾囊中，每侧一个。1.3.3实验分组与移植卵巢回收：将受体小鼠按给药不同分为两组：对照组和丹参组，各40只，分别于移植前1d至回收当日每天腹腔注射0.5mL生理盐水和0.5mL(含0.15g)丹参注射液。于移植后1d、2d和

7、14d三时间段回收。各时间段小鼠卵巢放入RNA-latter液中用于SODmRNA及iNOSmRNA的RT-PCR半定量测定，同时移植后14d回收移植物固定、石蜡包埋用来做HE染色及PA免疫组化分析。实验中另取移植后14d大B6C2F1雌性小鼠新鲜卵巢10个固定包埋作为卵巢卵泡计数的新鲜组。1.4观察指标与方法1.4.1组织学检查和全卵巢卵泡计数：移植后14d回收和14d新鲜卵巢，在Bouin’s液中固定过夜，石蜡包埋后5μm连续切片进行HE染色，高倍镜（×400）下进行卵泡计数。卵泡分类如下：①单层扁平颗粒细胞围绕卵母细胞的为原始卵泡。②单层立方颗粒细胞围

8、绕卵母细胞的为初级卵泡。③两层或以上立方颗粒细胞围绕