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1、吡格列酮对脂多糖引起的体外培养大脑皮层神经元NO【摘要】目的探讨吡格列酮(pioglitazon,Pio)能抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的培养大脑皮层神经元一氧化氮释放增加，并探讨其抑制作用信号转导机制。方法以体外培养6～7d的乳鼠大脑皮层神经元为研究对象,建立脂多糖损伤和吡格列酮保护模型。采用Griess法测定细胞培养上清液中NO含量。结果脂多糖可导致神经细胞损伤，培养液中NO含量升高；吡格列酮（1μmol/L）可明显抑制脂多糖引起的NO含量的升高。结论吡格列酮可明显拮抗脂多糖诱导的神经细胞损伤。【关键词】吡格列酮；脂多糖；神经元；NOAbstr
2、act：ObjectiveToexploretheexpresseffectsofpioglitazon(Pio)onlipopolysaccharide-inducedNOproductiontoculturedcorticalneuronsandinvestigateitssignalingpathmatoryneurotoxicitymodelarycorticalneuronsisolatedfromSprague-DaLfor8h),shoage,ol/L)ent.PioglitazonecouldblocktheincreaseofNOinducedbyLPS.Conc
3、lusionsPioglitazonecanpreventtheneuronsfromthedamageofLPSinflammatoryneurotoxicity.Keyer’sdisease，AD)以及帕金森病(Parkinsonisease,PD)等神经元变性疾病的发病过程［1］。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是一种以氨基苷为组成单位的磷脂，构成革兰阴性菌细胞壁成分，是一种强效的炎症反应诱导剂。Heneka等研究表明布洛芬和吡格列酮可以通过激活过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisomeproliferators-activatedreceptor,
4、PPAR)γ受体减轻神经胶质细胞的炎症反应［2］。XingB等研究指出，吡格列酮对抗脂多糖诱导的多巴胺能神经元损伤通过抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和NO的产生［3］。NO是体内广泛存在的一种细胞信使分子，具有生理性代偿和病理性神经毒双重作用。本实验通过体外培养乳鼠皮层神经元细胞，经LPS刺激造成神经元损伤模型，观察吡格列酮是否能抑制LPS引起的神经元NO释放增加，同时探讨吡格列酮抑制NO释放的可能的信号转导机制。1材料与方法1.1药品和试剂吡格列酮由Takeda公司提供(批号：060901，纯度>99%)，用二甲基亚砜溶解。二甲基亚砜、脂多糖、DMEM、F12、胰蛋
5、白酶（1∶250）、L-多聚赖氨酸购于SIGMA公司；G001)、SP600125(货号：JBS-INH-006-M002)购于厦门励远有限公司；一氧化氮检测试剂盒（货号：S0021）购于碧云天生物技术研究所；胎牛血清、HEPES、马血清购于北京华美转导科技有限公司；临用前用DMEM稀释到所需浓度，其余试剂均为分析纯。1.2大脑皮层神经元细胞原代培养参照文献［4］,取出生24h内的SD大鼠乳鼠,75%酒精浸泡消毒，无菌条件下取出大脑皮层，置于培养基中，剔除血管和软脑膜，用培养基清洗1～2次。将脑组织移入另一含培养基的容器中，然后剪成1mm3大小的组织块。加入0.125%胰蛋白酶溶液
6、37℃消化10min,并不时轻轻吹打。待大部分细胞分散后，即加入完全培养基终止消化。200目筛网过滤,1000转离心10min,用含10%胎牛血清、10%马血清的完全培养基将细胞制成悬液,调整细胞密度,以5×105/mL接种在多聚赖氨酸处理过的培养板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。48h后加入含阿糖胞苷(终浓度为5mg/L)的维持培养基,抑制非神经细胞增殖。以后每3天换液1次,培养7d后用于实验。1.3药物处理神经元细胞培养7d后，首先用终浓度为10μg/mL的LPS分别加入培养基中共同培养1、2、4、8、16、24、48h观察LPS对NO释放的时间变化规律；加吡格列酮组：
7、在培养基中加入终浓度为1μmol/L吡格列酮作用1h后加入LPS10μg/mL共同培养8h；阻断剂组：在培养基中加入终浓度为5μmol/L的JNK通路的特异性阻断剂SP600125共同培养一小时后加入LPS10μg/mL再共同培养8h。1.4指标检测Griess法测定培养液中NO的含量［5］。Griess法原理是根据NO2+与Griess试剂反应生成红色化合物，颜色深浅与体系中的NO3+/NO2+含量成正比，从而测定NO含量，是一种间接检测NO的方法。以1mol·L-
