mmp2、 mmp9与ⅳ型胶原在大肠癌中的表达及其相关性研究

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1、MMP2、MMP9与Ⅳ型胶原在大肠癌中的表达及其相关性研究【关键词】大肠肿瘤;IV型胶原;基质金属蛋白酶;免疫组化基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）在降解细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）和基底膜（basementmembrane,BM）及肿瘤细胞穿透血管或淋巴管向远处转移或直接侵入到周围组织的过程中,发挥了重要作用。IV型胶原是细胞外基质的主要成分之一,构成基底膜并能调控细胞黏附［1］,近年来研究发现其与恶性肿瘤的浸润扩散有关［2］。IV型胶原酶（包括MMP2和MMP9）因参与ECM和BM的主要成分IV

2、型胶原的降解而与肿瘤的侵袭和转移关系更为密切［3］。我们对30例大肠癌手术标本进行IV型胶原及MMP2、MMP9的免疫组织化学观察,探讨IV型胶原在大肠癌组织中的分布和表达及其与MMP2、MMP9的相关性。1材料和方法1．1材料中南大学湘雅医院大肠癌手术切除的大肠组织30（男16,女14）例,年龄26～71（平均56.45）岁;结肠癌9例,直肠癌21例,Dukes’B期11例,Dukes’C期19例。癌组织取自癌块边缘肉眼观新鲜、坏死组织少的部位;正常组织取自距癌块10cm以上的大肠切缘,经病理切片证实无癌。即癌组织样本数和正常组织样本数均为30例,所有标本均全层（包

3、括黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层）锐刀切取,标本大小约1.0cm×1.0cm,以100mL/L甲醛固定,石蜡包埋,组织切片。全部癌组织及正常组织均经病理学证实。小鼠抗人IV型胶原单克隆抗体（mAb）、小鼠抗人MMP2mAb、小鼠抗人MMP9mAb、免疫组化染色试剂盒（含封闭用正常山羊血清工作液、生物素化二抗工作液、辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液）、DAB显色剂（包括DAB、TBS、H2O2三种试剂）均购自北京中山生物技术有限公司。1.2方法1.2.1免疫组化染色切片脱蜡、梯度乙醇水化后用30mL/L过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶;滴加正常山羊血清封闭,37℃孵育10

4、min;滴加一抗工作液（稀释度1∶50）,4℃过夜;滴加二抗（稀释度1∶50）,37℃孵育45min;滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液（稀释度1∶50）,37℃孵育15min;DAB显色,苏木素复染、脱水、透明、封片。每步均经PBS洗涤3次,每次5min。1.2.2结果判定IV型胶原抗体阳性反应采用以下方法进行计分。1分:基底膜抗体反应很弱或无反应;2分:25％～75％腺体的基底膜出现抗体阳性反应,但呈间断性;3分:75％～100％腺体的基底膜出现连续性抗体阳性反应。MMP2、MMP9检测结果评定采用以下方法:腺管上皮细胞中未见染色为阴性,细胞质中见到棕黄色细颗粒状

5、染色为阳性。1.2.3统计学分析在癌组织与正常组织中MMP2、MMP9表达情况比较采用McNemar四格表配对检验,IV型胶原表达与MMP2、MMP9表达的相关性采用列联表Spearman等级相关进行分析。所有计算均使用SPSS10.0和SAS6.12软件包进行处理。P<0.05表示有统计学意义。2结果2.1正常大肠组织和癌组织中IV型胶原的表达IV型胶原染成棕黄色,在正常大肠组织中见于腺管上皮和血管壁周围的基底膜,在基底膜形成较粗的连续性环形结构,少数可见基底膜连续性中断（图1A）。在大肠癌中,在大部分癌巢的周边无正常组织那种环绕基底膜形成的环状结构,表现为偶

6、然的灶性中断,明显的不连续,染色浅淡或缺失（图1B）。其中计分为1分者9例,2分者13例,3分者8例,IV型胶原表达明显降低者占70.0%。2.2正常大肠组织和癌组织中MMP2、MMP9的表达MMP2、MMP9在大部分正常腺管上皮细胞中均未见表达,仅少数见到有阳性表达,且染色较浅淡（图2）。大部分癌组织中可见到癌细胞质中明显阳性表达,且染色较深（图3）。在大肠癌组织和正常大肠组织中,MMP2的阳性表达率分别为56.7％（17/30）和6.7％（2/30）;MMP9的阳性表达率分别为70.0％（21/30）和10％（3/30）。两者在正常组织和癌组织中的表达率均有统

7、计学意义（P<0.01）。2.3癌组织中IV型胶原评分与MMP2、MMP9表达的相关性分析IV型胶原评分与MMP2表达之间的相关性在统计学上无统计学意义（r＝-0.04157,P>0.05）。IV型胶原评分与MMP9表达之间呈负相关（r＝-0.60690,P<0.01）,即MMP9阳性表达者IV型胶原表达降低。本研究结果表明,IV型胶原在正常大肠组织中见于腺管上皮和血管壁周围的基底膜,在基底膜形成较粗的连续性环形结构;而在大肠癌组织中,在大部分癌巢的周边无正常组织那种环绕基底