磁共振示踪技术检测胶质瘤给药过程

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1、磁共振示踪技术检测胶质瘤给药过程　　胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，占恶性脑肿瘤的81%。胶质瘤通常会导致显著的致残率和死亡率。在过去的几十年中，治疗方法不断改进。　　目前，放疗联合化疗是手术后的一线辅助治疗。　　然而，几乎所有的胶质母细胞瘤患者在7～10个月无进展生存期中位期后都会出现病情进展。因此，胶质母细胞瘤总体上难治且预后差。实际上大多数化疗药物不能通过血脑屏障，因而药物到达肿瘤靶点的效率低下。研究人员相继发明了诸多新的治疗策略，其中局部给药可以直接绕过血脑屏障。局部给药具体包括，局部注射、对流增强给药和各种埋置多聚物。局部给药可以将

2、高生物利用度的制剂直接作用于靶点，而且几乎没有药物损耗。然而，溶液回流和水肿等多种副作用阻碍了对流增强给药(CED)发展成一个用于神经胶质瘤的标准治疗系统．为克服上述缺陷，人们建立了一种磁共振实时成像的方法来监测给药过程，但却没有定量计算局部扩散和清除参数。本课题组首先应用磁共振示踪技术定量测量了正常大鼠脑尾状核、丘脑、枕叶皮质和黑质的扩散和清除参数。本研究首次应用磁共振示踪技术定量比较了C6胶质瘤10d模型和20d模型扩散和清除参数的差异，并且对影响扩散和清除的细胞外基质成分进行了免疫组化和蛋白质印迹分析比较。　　1材料和方法　　1.1溶

3、液制备和实验动物　　用双蒸水稀释钆二乙三胺五乙酸(Gd-DTPA，马根维显，拜耳先灵制药，德国)至10mmol/L。本研究方案获得了北京大学医学部动物伦理委员会的批准(批号No．LA2012-016)。16只成年雄性SD大鼠，清洁级，体重(250～300)g，北京大学医学部实验动物科学部提供，实验动物生产许可证号SCXK(京)2011-0012。实验动物使用许可证号:SYXK(字)2011－0039。随机分为两组:10d胶质瘤组(n=8)和20d胶质瘤组(n=8)。C6大鼠胶质瘤细胞系(ATCCNo．CCL107)培养如以往报道。　　大鼠(

4、n=8)经腹膜内注射戊巴比妥钠、乙醇、水合氯醛、硫酸镁和丙二醇混合物(3mL/kg)麻醉后，固定于立体定位仪(Stoelting，美国)。在头皮沿矢状缝从两耳间区域至两眼间区域做正中切口，小心分离脑膜暴露前囟。右侧颅骨表面定位钻孔(前囟前，1mm;右旁开，3.5mm)。C6细胞悬液(5106cellsin10μL)经颅骨孔缓慢注入(10min)右侧尾状核(前囟前，1mm;右旁开，3.5mm;深，5.0mm)。微量进样器停针5min。颅骨孔用骨蜡封闭，头皮缝合。　　1.2MRI示踪法示踪大鼠C6胶质瘤模型细胞外间隙扩散　　大鼠麻醉如前所

5、述，实验过程中适时追加保持麻醉状态(约为0.7mL/kg/h)。大鼠置于加热垫(38±0.5)°C上保持体温。预扫描将大鼠置于西门子磁共振成像(MagomTrio，Germany)系统腕线圈中，用T1加权三维磁化准备快速采集梯度回波序列(T13DMP-RAGE)扫描。获得用于图像后处理的预扫描图像并用于确定穿刺位点。大鼠颅顶备皮，碘伏消毒。沿矢状缝从两耳间区域至两眼间区域开头皮，小心分离脑膜暴露前囟。将大鼠置于立体定位仪上，根据MRI预扫描结果显示的肿瘤生长情况在颅骨表面重新定位钻孔，向肿瘤中心区域微量注射10mmol

6、/LGd-DTPA溶液2μL(注射时间10min)。注射Gd-DTPA后不同时间点，15min、30min、第1、2、3、4、5、6小时行磁共振扫描成像。成像序列和参数如前所述。　　1.3图像后处理和参数计算　　用MATLAB7.8软件(MathP-RAGE序列扫描的Gd-DTPA浓度与信号强度增量(ΔSI)的线性关系。与以往的1/T1值与Gd-DTPA浓度关系相比更有利于实时成像计算。MRI示踪法定量细胞外间隙扩散的主要参数包括自由扩散系数(D)，有效扩散系数(D*)，迂曲度(λ)和清除速率常数(k)．根据

7、本课题组已经报道的方法进行参数计算。为测量脑组织间液流动参数半衰期(thalf-life)，将高于背景噪音两个标准差的的信号强度作为阈值，逐层提取感兴趣区内的所有像素得到各扫描时间点Gd-DTPA总量(Gdsum)。由于Gd-DTPA在脑内按一级动力学常数清除，Gd-DTPA的半衰期可以通过曲线拟合得到(Gdsum=e－kt)，其中半衰期(thalf-life)根据thalf-life=ln(2/k)进行计算。　　【图１、２略】　　1.4免疫组化　　选取典型的细胞外基质大分子进行免疫组化分析。5μm石蜡切片脱蜡后，3%过氧化氢避光浸泡

8、，抗原热修复。分别滴加抗硫酸软骨素蛋白多糖、腱生蛋白C、IV型胶原蛋白一抗(兔抗大鼠;1∶200;博奥森)，4℃过夜;加二抗常温孵育30min。DAB显色，苏木素复染细胞核。